3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của cây Trung quân (Ancistrocladus
3.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất phân lập từ loài Trung
(Ancistrocladus cochinchinensis)
3.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis
Các chất có khả năng ức chế vi sinh vật thể hiện hoạt tính diệt hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật đó. Dựa vào đặc điểm đó, các phép thử sinh học đã được phát triển, nhằm đánh giá khả năng này của các hợp chất sạch hoặc dịch chiết động thực vật hay vi sinh vật. Nghiên cứu sử dụng phép thử khuếch tán giếng trên đĩa thạch, khả năng ức chế vi sinh vật sẽ được đánh giá thông qua bán kính vòng ức chế vi sinh vật (hay vòng vô khuẩn) được tạo ra ở xung quanh các giếng trên đĩa thạch khi bổ sung dịch thử. Bán kính này càng lớn, thì hợp chất đó có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật thử càng mạnh.
Hoạt tính kháng vi sinh vật của các 06 hợp chất phân lập từ loài A. cochinchinensis được tiến hành với 3 chủng vi sinh vật kiểm định, trong đó có 2 chủng Gram âm là Escherichia coli và Salmonella tiphymurium; 1 chủng Gram dương là Staphylococcus aureus cùng 2 chủng nấm là Candida albicans và Aspergillus fumigatus. Mỗi thí nghiệm được lặp 3 lần và kết quả đo bán kính vòng kháng vi sinh vật thu được sau 3 lần thí nghiệm lặp lại được tính giá trị trung bình. Thí nghiệm tiến hành trên 3 nồng độ dịch thử là 20µg/ml, 50µg/ml và 100µg/ml.
3.1.1.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn
Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế vi khuẩn E. coli của các mẫu từ AC1 đến AC6 tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli của 6 hợp chất phân lập
STT
VSV thử nghiệm
Tên mẫu
Hoạt tính ức chế vi khuẩn E.coli (mm) Nồng độ dịch thử µg/ml 20 50 100 1 AC1 - - - 2 AC2 0,5 1,15 ± 0,94 1,67 ± 0,94 3 AC3 - - - 4 AC4 0,67 ± 0,23 1,33 ± 0,47 2,33 ± 0,47 5 AC5 - 0,5 1,2 ± 0,15 6 AC6 - - 0,5 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 7,5 7,5 7,5 Trong đó:
Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
( - ): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Kanamycine 0,1 mg/ml.
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Đối chứng âm: DMSO
Kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy đa phần các hợp chất phân lập từ loài A. cochinchinensis bắt đầu thể hiện khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật gây bệnh. Quan sát các đĩa thạch thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy hoạt động của các chất làm đối chứng dương (kanamycine) ổn định ở tất cả các đĩa trong các lần lặp lại thí nghiệm. Đối chứng âm DMSO hoàn toàn không có vòng ức chế vi sinh vật xuất hiện. Đối với vi khuẩn Gram âm E. coli, hai hợp chất AC2 và AC4 bắt đầu thể hiện biểu hiện hoạt tính ức chế ở nồng độ 20µg/ml.
Khi tăng dần nồng độ chất thử, bán kính vòng vô khuẩn cũng tăng lên. Hợp chất AC4 đã thể hiện khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn E. coli
tốt nhất với bán kính kháng khuẩn là ở nồng độ 100µg/ml là 2,33 ± 0,47mm. Ở nồng độ thử nghiệm này, hoạt tính của hợp chất AC4 đã tương đương 25% của chất đối chứng dương là kháng sinh Kanamycine. Kém hơn so với hợp chất AC2 và AC4, hợp chất AC5 biểu hiện hoạt tính ức chế bắt đầu ở nồng độ 50µg/ml. Hợp chất AC6 chỉ biểu hiện hoạt tính ức chế ở nồng độ thử nghiệm cao nhất 100µg/ml. Hai hợp chất AC1 và AC3 không biểu hiện hoạt tính ức chế đối với vi khuẩn E. coli ngay cả khi tăng nồng độ thử nghiệm lên 100µg/ml.
Hoạt tính ức chế vi khuẩn Staphylococus aureus của 6 hợp chất nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus
STT VSV thử nghiệm Tên mẫu Hoạt tính ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus (mm) Nồng độ dịch thử µg/ml 20 50 100 1 AC1 1,22±0,41 1 1,53±0,38 2 AC2 1,67±0,47 2,33±0,23 3 3 AC3 1,56 1,88±0,23 2 4 AC4 1,16±0,23 3 4,67±0,23 5 AC5 1, 0±0,41 1,37±0,47 2,15±0,68 6 AC6 2,08±0,32 3,15±0,24 4,58±0,26 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 6 6 6 Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
(-): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Kanamycine 0,1 mg/ml.
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Kết quả tại bảng 3.2 cho thấy 6 hợp chất thử nghiệm đều biểu hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus. Đối chứng âm và đối chứng dương hoạt động ổn định. Đáng chú ý là hai hợp chất AC4 và AC6 có hoạt tính ức chế vi khuẩn S.aureus tương đối tốt.Tuy không thể hiện hoạt tính với các vi khuẩn Gram âm, hợp chất AC6 lại có hoạt tính mạnh với vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus. Vòng kháng khuẩn bán kính 2mm đã đo được khi bổ sung 20µg/ml hợp chất AC6 vào các đĩa nuôi cấy Staphylococcus aureus. Ở nồng độ 100µg/ml, hoạt tính của hợp chất AC6 tương đương 80% so với đối chứng Kanamycine. Hợp chất AC4 cũng có hoạt tính tương tự hợp chất AC6, với giá trị vòng kháng khuẩn trung bình dao động từ 1,16mm- 4,67mm ở nồng độ 20-100µg/ml. Các hợp chất AC2, AC3 biểu hiện hoạt tính ức chế ở mức độ trung bình còn hợp chất AC1 và AC5 có hoạt tính kháng
Staphylococcus aureus yếu nhất.
Hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella tiphymurium thể hiện tại bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella tiphymurium
STT VSV thử nghiệm Tên mẫu Hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella tiphymurium (mm) Nồng độ dịch thử µg/ml 20 50 100 1 AC1 0,5 0,90±0,41 1,23±0,55 2 AC2 0,75±0,25 1,1±0,41 1,67±0,54 3 AC3 0,5 0,75±0,43 0,87±0,41 4 AC4 2,12±0,89 3,12±1,13 4,12±1,24 5 AC5 0,5 0,75±0,43 0,87±0,41 6 AC6 - - - 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 10,5 10,5 10,5 Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
( - ): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Kanamycine 0,1 mg/ml.
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Hợp chất AC4 cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên chủng vi khuẩn Gram âm là Salmonella tiphymurium. Ở nồng độ 20µg/ml, hợp chất AC4 đã có khả năng tạo ra vòng vô khuẩn với bán kính trung bình khoảng 2mm. Ở nồng độ 100µg/ml, bán kính vòng kháng khuẩn đạt tới hơn 4mm, tương đương với 40% đối chứng dương. Các hợp chất AC1, AC2, AC3 và AC5 đều bắt đầu thể hiện hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn
Salmonella tiphymurium. Ở nồng độ 20µg/ml, vòng vô khuẩn đã bắt đầu quan sát được khi bổ sung 4 hợp chất này vào đĩa nuôi Salmonella tiphymurium. Tăng nồng độ hợp chất xử lý, bán kính vòng vô khuẩn cũng tăng nhưng không đáng kể, cao nhất là hợp chất AC2, sau đó đến AC1 cuối cùng AC3 và AC5. Bán kính vòng kháng khuẩn của các mẫu này dao động trong khoảng 0,87-1,67mm. Không có vòng kháng khuẩn nào quan sát được khi bổ sung mẫu AC6. Như vậy, hợp chất này không có khả năng ức chế sinh trưởng của
Salmonella tiphymurium ngay cả ở nồng độ thử nghiệm tối đa là 100µg/ml. Quá trình nghiên cứu thực nghiệm ghi nhận được hình ảnh vòng kháng khuẩn của hợp chất AC1 và AC4 lên 3 loài vi khuẩn thử nghiệm (hình 3.1).
100 100 100 50 50 50 20 20 20 (-) (-) (-) (+) (+) (+)
Salmonella tiphymurium Staphylococcus aureus Escherichia coli
100 50 20 (-) (+) 100 100 50 50 20 20 (-) (-) (+) (+)
Salmonella tiphymurium Staphylococcus aureus Escherichia coli
Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của hợp chất AC1 (M1), AC4 (M4) đối với 3 loài vi khuẩn
(+): Đối chứng âm (-): Đối chứng âm
Với công dụng chữa bệnh sốt rét ở nhiều vùng Đông Nam Á và Châu Phi hay là thuốc giảm sốt, đau nhức răng, hoạt tính kháng khuẩn của cây Trung quân cũng được quan tâm nghiên cứu. Hoạt tính sinh học của các nhóm chất phân lập từ Trung quân như ancistrocladine, dioncophylline A và ancistrocladinium A cho thấy khả năng ức chế rõ rệt sự sinh trưởng ở mức in vitro của ký sinh trùng gây nhiều bệnh truyền nhiễm vùng nhiệt đới như: Plasmodium falciparum và
Plasmodium berghei gây bệnh sốt rét [27] Leishmania donovani gây bệnh
Leishmania (bệnh do muỗi cát truyền) [49]; Trypanosoma cruzi và T. brucei rhodesiense gây bệnh ngủ [18]. Ở Việt Nam, cây Trung quân cũng là thành phần chính của bài thuốc chữa kiết lỵ của bà con vùng rừng quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế hoặc dùng phối hợp với rễ cây thường sơn để trị sốt rét của dân tộc Bân, Ê đê vùng Gia Lai. Đa phần các hợp chất AC1-AC6 đều bắt đầu thể hiện khả năng ức chế sự sinh trưởng của 3 chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm trong đó hợp chất AC4, AC6 có hoạt tính ức chế vi khuẩn S. aureus tương đối tốt và hợp chất AC4 có hoạt tính ức chế vi khuẩn S. typhimurium với bán kính vòng kháng khuẩn dao động 4,5mm ở nồng độ thử nghiệm là 100 μg/ml. Đối với vi khuẩn E. coli hợp chất AC4 cũng thể hiện khả năng ức chế ở mức độ trung bình. Ba chủng vi sinh vật kiểm định dùng trong nghiên cứu này là E. coli,
S. aureus và S. typhimurium đều là những vi khuẩn có liên quan đến các bệnh tiêu chảy, ngộ độc thực phẩm. Hợp chất AC4 và AC6 với khả năng ức chế sự sinh trưởng của ba vi khuẩn này phần nào giải thích cơ sở khoa học cho việc sử dụng lá Trung quân trong bài thuốc chữa bệnh đường ruột trong dân gian.
3.1.1.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh
Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của 6 hợp chất từ AC1 đến AC6 được nghiên cứu trên nấm Candida albicans và Aspergillus fumigatus. Thí nghiệm tiến hành trên 3 nồng độ dịch thử là 50 µg/ml, 100µg/ml và 200µg/ml. Đối chứng dương được sử dụng là chất kháng nấm Ciclopiroxolamine nồng độ 0,1mg/ml. Với 3 lần lặp lại thí nghiệm, Ciclopiroxolamine đều thể hiện hoạt tính kháng hai loại nấm A. fumigatus và C. albicans với bán kính ức chế tương ứng là 37 và 26mm (Bảng 3.4, 3.5).
Khả năng ức chế nấm Candida albicans được trình bày tại bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng ức chế nấm Candida albicans
TT Nấm thử hoạt tính Tên mẫu Hoạt tính ức chế nấm C. albicans (mm) Nồng độ dịch thử (µg/ml) 50 100 200 1 AC1 - 0,5 1,2±0,28 2 AC2 - - - 3 AC3 - - - 4 AC4 - - - 5 AC5 - - 1,33±0,33 6 AC6 - - - 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 26 26 26
Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
( - ): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Ciclopiroxolamine 0,1mg/ml.
Đối chứng âm: DMSO
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Dựa trên kết quả thử nghiệm có thể thấy hầu hết các hợp chất đều không thể hiện hoạt tính ức chế nấm bệnh Candida albicans. Trong đó có 4 hợp chất AC2, AC3, AC4, AC6 không biểu hiện hoạt tính ở cả 3 nồng độ 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml. Hợp chất AC1, AC5 có hoạt tính nhưng với nồng độ hoạt động tương đối cao, đặc biệt AC5 chỉ biểu hiện ở nồng độ 200µg/ml và bán kính vùng ức chế nhỏ hơn nhiều so với đối chứng dương.
Thử nghiệm hoạt tính ức chế nấm bệnh A. fumigatus được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Khả năng ức chế nấm A. fumigatus TT Nấm thử hoạt tính Tên mẫu Hoạt tính ức chế nấm A. fumigatus (mm) Nồng độ dịch thử (µg/ml) 50 100 200 1 AC1 - 0,5 1,2±0,28 2 AC2 - - - 3 AC3 - - - 4 AC4 - - - 5 AC5 - - 1,33±0,33 6 AC6 - - - 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 37 37 37
Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
( - ): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Ciclopiroxolamine 0,11 mg/ml.
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Đối chứng âm: DMSO
Khả năng ức chế nấm A. fumigatus cũng hầu như không biểu hiện khi sử dụng các hợp chất thử nghiệm. Cũng giống như đối với nấm
Candida albicans, chỉ có hợp chất AC1 và AC6 biểu hiện hoạt tính ức chế nấm A. fumigatus ở mức độ trung bình với bán kính vùng ức chế của AC1 và AC6 lần lượt là 1,2±0,28 và 1,33±0,33 mm ở nồng độ 200µg/ml trong khi đó đối chứng dương cho kết quả là 37 mm ở nồng độ 50 µg/ml.