3. Nội dung nghiên cứu
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất được phân lập từ chi Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis bằng phương pháp khuếch tán giếng trên đĩa thạch (agar well diffusion method) theo Hadacek và đồng tác giả (2000), Trần Mỹ Linh và đồng tác giả (2013) [8], [31] gồm các bước sau:
Chủng vi sinh vật sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc (đối với vi khuẩn) hoặc môi trường Hansen (đối với nấm), một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường lỏng tương ứng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C (đối với vi khuẩn) hoặc 250C (đối với vi nấm). Vi khuẩn được nuôi phục hồi bằng cách nuôi 0,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm trong 12,5 ml môi trường LB lỏng trong vòng 3 giờ đến khi giá trị đo OD600 dung dịch nuôi khuẩn bằng 0,8.
Sau đó, đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 µl dịch vi sinh vật (OD600 = 0,4 - 0,5) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường đặc, để khô và đục 5-6 giếng đường kính 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2- 3 cm.
Dịch chiết thử được chuẩn bị bằng cách hòa tan chất bột đã tinh chế được trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) thành các nồng độ theo yêu cầu. Tiếp đó, bổ sung 50 µl dịch chiết thử, đối chứng dương, đối chứng âm vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy; sau đó đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 16-18 h (đối với vi khuẩn) hoặc 250C trong 48h (đối với nấm).
Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh Kanamycin 0,1 mg/ml đối với 3 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, dung dịch kháng nấm Ciclopiroxolamine 1 mg/ml Candida albicans và A. fumigatus. Đối chứng âm là DMSO.
Hoạt tính ức chế sinh vật được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:
BK (mm) = D-d
Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị BK trung bình.
2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa thu dọn gốc tự do DPPH
Các mẫu hoạt chất thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH.
Nguyên tắc của phương pháp: Phân tử 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, (DPPH) được xem là phân tử mang gốc tự do ổn định thông qua sự chuyển dịch vị trí của một nguyên tử tự do trên toàn bộ phân tử của nó. Điều đáng chú ý là phân tử khi hòa tan trong cồn tuyệt đối (absolute ethanol) sẽ tạo ra mầu tím thẫm của dung dịch và có thể đo được phổ hấp thụ ở bước sóng 520 nm. Gốc tự do DPPH có thể nhận một điện tử hoặc một gốc Hydro để trở thành một phân tử nghịch từ và có mầu tím nhạt.
Khi một cơ chất được đưa vào dung dịch chứa DPPH và tạo ra mầu tím nhạt thì hoạt động đó được xem là có hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH, có hoạt tính chống oxi hóa thông qua cơ chế trung hòa gốc tự do. Nếu khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do của mẫu thử càng mạnh thì mầu tím càng nhạt và ngược lại. Phổ hấp thụ vì thế sẽ được đánh giá tại bước sóng λ = 517 nm và kết quả được so với mẫu đối chứng, không chứa chất thử.
Cách tiến hành:
Từ nồng độ gốc mẫu 5 mg/ml được pha trong DMSO, tiến hành pha dải nồng độ thử mẫu: 200-100-50-10 µg/ml với nước cất khử ion. Sau đó, chuẩn
bị dung dịch Ascorbic acid trong nước cất khử ion, sử dụng làm đối chứng dương với giải nồng độ thử 100-50-10-2-0,4 µg/ml.
DPPH sẽ được pha trong DMSO (tương tự như pha mẫu thí nghiệm) nồng độ 100 µM, tỉ lệ mẫu: DPPH = 1:1. Thí nghiệm được bắt đầu bằng Chuyển 100 µl mẫu nghiên cứu vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng; mỗi nồng độ thử chất được lặp lại 3 lần rồi tiếp tục đưa 100 µl dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên và các giếng đã có sẵn mẫu nghiên cứu. Sau đó, ủ đĩa ở 37º C trong 30 phút trên máy lắc và xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đọc ELISA 96 giếng.
Giếng có dung môi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH được xem là giếng trắng.
Giếng có sử dụng Ascorbic acid (VitC) là chất đối chứng dương.
Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
%SA = (OD đối chứng - OD mẫu thử)*100/OD đối chứng (%)
Trong đó: OD đối chứng: Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử. OD mẫu thử: Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử.
Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.
2.4.3. Phương pháp thử độc tính tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B
(SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [47], [33], [52], [40].
Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Chất thử (20 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ nồng độ 100g/ml, 20 g/ml; 4g/ml; 0,8g/ml. Tiếp đó, trypsin hóa DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng, rồi thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. Song song với thí nghiệm, một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid - TCA.Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% sống sót =
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) % ức chế = 100% - % sống sót
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4g/ml; 0,08 g/ml.
DMSO 10% được sử dụng làm đối chứng âm. Giá trị IC50(nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50< 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.