TT Nấm thử hoạt tính Tên mẫu Hoạt tính ức chế nấm C. albicans (mm) Nồng độ dịch thử (µg/ml) 50 100 200 1 AC1 - 0,5 1,2±0,28 2 AC2 - - - 3 AC3 - - - 4 AC4 - - - 5 AC5 - - 1,33±0,33 6 AC6 - - - 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 26 26 26
Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
( - ): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Ciclopiroxolamine 0,1mg/ml.
Đối chứng âm: DMSO
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Dựa trên kết quả thử nghiệm có thể thấy hầu hết các hợp chất đều không thể hiện hoạt tính ức chế nấm bệnh Candida albicans. Trong đó có 4 hợp chất AC2, AC3, AC4, AC6 không biểu hiện hoạt tính ở cả 3 nồng độ 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml. Hợp chất AC1, AC5 có hoạt tính nhưng với nồng độ hoạt động tương đối cao, đặc biệt AC5 chỉ biểu hiện ở nồng độ 200µg/ml và bán kính vùng ức chế nhỏ hơn nhiều so với đối chứng dương.
Thử nghiệm hoạt tính ức chế nấm bệnh A. fumigatus được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Khả năng ức chế nấm A. fumigatus TT Nấm thử hoạt tính Tên mẫu Hoạt tính ức chế nấm A. fumigatus (mm) Nồng độ dịch thử (µg/ml) 50 100 200 1 AC1 - 0,5 1,2±0,28 2 AC2 - - - 3 AC3 - - - 4 AC4 - - - 5 AC5 - - 1,33±0,33 6 AC6 - - - 7 Đối chứng âm - - - 8 Đối chứng dương 37 37 37
Giá trị biểu hiện ở các cột: Bán kính vùng ức chế (mm).
( - ): không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương: Ciclopiroxolamine 0,11 mg/ml.
Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
Đối chứng âm: DMSO
Khả năng ức chế nấm A. fumigatus cũng hầu như không biểu hiện khi sử dụng các hợp chất thử nghiệm. Cũng giống như đối với nấm
Candida albicans, chỉ có hợp chất AC1 và AC6 biểu hiện hoạt tính ức chế nấm A. fumigatus ở mức độ trung bình với bán kính vùng ức chế của AC1 và AC6 lần lượt là 1,2±0,28 và 1,33±0,33 mm ở nồng độ 200µg/ml trong khi đó đối chứng dương cho kết quả là 37 mm ở nồng độ 50 µg/ml.
3.1.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis
Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH.
Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được thể hiện ở bảng 3.6, căn cứ vào giá trị SA của mẫu thử nghiệm và phần mềm máy tính chuyên dụng tính được giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH).
Bảng 3.6. Khả năng chống oxy hóa của hợp chất thử nghiệm Nồng Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Giá trị SA (%) Nồng độ đối chứng (µg/ml) Giá trị SA (%)
AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6 ascorbic
acid 200 66,21 68,12 69,64 74,64 63,14 64,76 100 89,44 100 47,92 39,23 48,54 50,64 48,27 48,67 50 86,98 50 30,18 23,58 25,69 37,16 30,56 25,28 10 63,72 10 7,16 7,98 8,73 17,25 8,92 7,26 2 37,79 0.4 17,03 SC50 114,74 126,35 118,14 76,16 119,88 123,76 SC50 4,40
Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa invitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxi hóa sử dụng phép phân tích này [44]. Khả năng khử gốc tự do DPPH của các hợp chất tách chiết từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis được thể hiện trong bảng 3.6, giá trị SC50 càng thấp khả năng chống oxy hóa càng cao. Từ đây cho thấy các hợp chất khảo sát đều có hoạt tính kháng oxy hóa không đáng kể so với vitamin C, một hợp chất được biết có hoạt tính kháng oxi hóa rất tốt và có
nhiều ứng dụng thương mại. Căn cứ giá trị SA và SC của 6 mẫu thử nghiệm cho thấy hợp chất AC4 có giá trị SA lớn nhất so với các hợp chất còn lại ở từng nồng độ thử nghiệm tương ứng và SC50 nhỏ nhất thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do tốt hơn cả, ở nồng độ 76,16 µg/ml có khả năng trung hòa 50% gốc tự do của DPPH.
Biểu đồ 3.1. Giá trị SC50 của 6 hợp chất thử nghiệm và đối chứng
Biểu đồ 3.1 so sánh giá trị SC50 của 6 hợp chất thử nghiệm với nhau và với đối chứng. Giá trị SC50 của các hợp chất AC1, AC2, AC3, AC5, AC6 cao hơn rất nhiều so với đối chứng. Hợp chất AC4 có thể mở ra triển vọng trong việc tìm kiếm thêm các hợp chất mới có khả năng chống oxy hóa.
3.1.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis
Rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư đã được phân lập từ chi Ancistrocladus, hứa hẹn khả năng ứng dụng của chúng trong việc chữa trị ung thư, một căn bệnh nan y hiện nay.
Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào được xác định bằng % số tế bào bị ức chế. Con số này càng lớn chứng tỏ khả ăng ức chế dòng tế bào ung thư của hợp chất đó càng cao.
Tiến hành sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tách chiết từ cây Ancistrocladus cochinchinensis theo phương pháp đã mô tả chúng tôi đã thu được những kết quả như sau:
3.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào LU-1
Khả năng ức chế dòng tế bào LU-1 của 6 hợp chất được thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư LU-1
Nồng độ (µg/ml)
Dòng tế bào LU-1 (% ức chế)
AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6
Ellipticine Nồng độ µg/ml % ức chế 100 12,62 18,60 15,80 21,82 101,32 19,08 10 98,22 20 -8,62 8,12 4,52 11,48 95,68 -0,04 2 75,77 4 -8,20 0,48 -2,32 0,02 24,76 -5,40 0.4 49,36 0.8 -10,52 -2,56 -2,98 -3,94 8,80 -8,14 0.08 23,88 IC50 >100 >100 >100 >100 6.52 ± 1.60 >100 0.43 ± 0.08
Trong số 6 hợp chất, hợp chất AC1 biểu hiện hoạt tính ức chế rất yếu, ở nồng độ thử nghiệm cao nhất 100µg/ml mới ức chế được 12% tế bào ung thư LU-1. Các hợp chất AC2, AC3, AC4, AC6 cũng biểu hiện khả năng tương tự. Đáng chú ý nhất trong số này có hợp chất AC5, bắt đầu có hoạt tính ức chế tế bào LU-1 ở nồng độ rất thấp 0,8µg/ml và hoạt động ức chế tỷ lệ thuận với nồng độ dịch thử. Tức là ở nồng độ càng cao thì khả năng ức chế tốt hơn. Biểu đồ 3.1 minh họa khả năng ức chế tế bào ung thư ở nồng độ dịch thử 100µg/ml. Ở nồng độ này cả 6 hợp chất đều biểu hiện hoạt tính, trong đó hợp chất AC1, AC6 không ức chế tế bào LU-1 ở các nồng độ thấp hơn, thậm chí các tế bào còn tiếp tục phát triển khi sử dụng nồng độ thử nghiệm đến 20µg/ml.
3.1.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào HL-60
Khả năng gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của 6 hợp chất được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư HL-60
Nồng độ (µg/ml)
Dòng tế bào HL-60 (% ức chế)
AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6
Ellipticine Nồng độ µg/ml % ức chế 100 31,25 28,62 44,76 21,71 100,36 41,47 10 98,22 20 27,30 10,92 19,11 11,65 99,04 14,57 2 75,77 4 5,90 3,27 -6,54 -0,68 33,09 8,53 0.4 49,36 0.8 4,11 -2,71 -8,51 -9,29 15,28 7,21 0.08 23,88 IC50 >100 >100 >100 >100 5.02 ± 1.22 >100 0.33 ± 0.03
Theo Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Hoa Kỳ, một chất có IC50 < 20 µg/ml được xem là có độc tính đối với tế bào. Kết quả IC50 còn giúp so sánh một cách đầy đủ hoạt tính gây độc tế bào giữa các mẫu với nhau. Nếu mẫu thử nào có giá trị IC50 thấp hơn, tức nồng độ ức chế 50% số tế bào đích thấp hơn thì chất đó có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn. Ở đây, có 5 trên tổng số 6 mẫu có IC50 >100 µg/mL cho thấy các mẫu hợp chất này có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào HL-60 tương đối yếu. Đáng chú ý nhất có hợp chất AC5 biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt, giá trị IC50 là 5,02±1,22.
3.1.3.3. Hoạt tính gây độc dòng tế bào SK-MEL-2
Đối với dòng tế bào SK-MEL-2 cả 6 hợp chất đều có biểu hiện gây độc tế bào.
Bảng 3.9. Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư SK-MEL-2
Nồng độ (µg/ml)
Dòng tế bào SK-MEL-2 (% ức chế)
AC1 AC2 AC3 AC4 AC5 AC6
Ellipticine Nồng độ µg/ml % ức chế 100 30,74 19,41 28,08 37,75 97,29 31,47 10 98,22 20 12,86 2,66 10,69 22,19 96,39 3,06 2 75,77 4 8,66 0,04 6,98 12,72 21,32 1,98 0.4 49,36 0.8 1,82 -0,32 3,18 2,23 10,44 -2,77 0.08 23,88 IC50 >100 >100 >100 >100 6.79 ± 2.01 >100 0.47 ± 0.09
Tỷ lệ tế bào sống sót phụ thuộc vào nồng độ dịch thử. AC2 và AC6 không gây độc tế bào ở nồng độ 0,8µg/ml, các tế bào ung thư phát triển bình thường. Đến nồng độ 4µg/ml bắt đầu có tế bào bị tiêu diệt nhưng với tỷ lệ thấp tương ứng là 4,04% và 1,98% . Các hợp chất AC1, AC3, AC4 cũng biểu hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư ngay từ nồng độ thử nghiệm đầu tiên 0,8µg/ml nhưng tỷ lệ ức chế cũng thấp, giá trị IC50 đều > 100. Đáng chú ý nhất trong số 6 hợp chất này là hợp chất AC5 biểu hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư tốt nhất, ở nồng độ 8µg/ml tỷ lệ ức chế là 10,44%. Nồng độ dịch thử càng tăng thì phần trăm tế bào ức chế càng cao. Giá trị IC50 của AC5 tương đối thấp 6,79 ±2,01 tương ứng với khả năng tiêu diệt tế bào ung thư SK-MEL-2 tốt hơn cả.
Biểu đồ 3.2: Phần trăm tế bào khối u bị ức chế ở nồng độ: 20µg/ml đối với chất thử và 10µg/ml đối với đối chứng dương Ellipticine
Nhìn vào biểu đồ 3.2 có thể nhận thấy rằng hợp chất AC5 có hoạt tính ức chế rất tốt đối với cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Hoạt tính dịch thử ở nồng độ 20µg/ml tương đương với hoạt động của chất đối chứng dương ở 10µg/ml.
Như vậy, kết quả đánh giá hoạt tính gây độc của 6 hợp chất thử nghiệm trên 3 dòng tế bào ung thư nghiên cứu cho thấy hợp chất AC5 có hoạt tính tốt nhất. Hoạt tính này thể hiện trên tất cả các dòng tế bào ung thư được sử dụng trong thí nghiệm, cho thấy hoạt chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư nói chung, không thấy tính hướng đích đặc biệt.
Nhóm nghiên cứu tại Viện Hóa học (Viện Hàn Lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam) cũng phân lập được từ loài A. cochinchinensis sinh trưởng tại Bình Định nhiều hợp chất alkaloid có giá trị như 6-O-methylhamateine, hamatinine, 6-O-methylhamatinine, 6-O-demethyl-7-epi-ancistrobrevine D, 7- epi- ancistrobrevine D and 6-O-demethyl-8-O-methyl-7-epi-ancistrobrevine D với hoạt tính gây độc tế bào và chống ôxy hóa [12], [13]. Trong quá trình tìm kiếm các hợp chất từ loài A. cochinchinensis sinh trưởng tại Vĩnh Phúc, ba hợp chất thuộc nhóm alkaloid là isoquinoline alkaloid (AC3), anciscohine 6- 0-β-D-glucopyranoside (AC4) và 4’-methoxy-5-epi-ancistecrorine (AC5) cũng được phân lập; trong đó hai hợp chất AC4 và AC5 là những hợp chất mới. Bên cạnh đó, một số hợp chất khác thuộc nhóm phenolic như Ancistronaphtoside A/B (AC1/2) và Tortoside A (AC6). Khi bổ sung vào các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư máu và ung thư biểu mô, hợp chất AC5 đã thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của các dòng tế bào này một cách rõ rệt. Giá trị ức chế IC50 của hợp chất AC5 lên các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư máu và ung thư biểu mô lần lượt là 6.52 ± 1.60, 5.02 ± 1.22, 6.79 ± 2.01 μg/mL (Bảng 3.7, 3.8, 3.9). Tương tự với loài A. cochinchinensis tại Việt Nam, alkaloids cũng là nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu phân lập được từ nhiều loài trong chi Trung quân như A. tectorius, A. heyneanus, A. cochinchinensis [17], [18].
Đặc biệt, hai hợp chất nhóm naphthylisoquinoline alkaloid là Dioncoquinones A và B phân lập từ loài A. heyneanus có khả năng ức chế mạnh mẽ các tế bào u tủy in vitro với giá trị ức chế IC50 ở nồng độ 11 μM [18], [19] mà không gây độc những tế bào bình thường. Theo Bringmann và cộng sự, khả năng diệt tế bào u tủy này của hai hợp chất Dioncoquinones A và B tương tự như melphalan, một hợp chất đang được nghiên cứu phát triển cho hóa trị liệu. Với giá trị IC50 trong khoảng 5-6 μg/mL tương đương với 12-14 μM, hợp chất AC5 đã thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư phổi, ung thư máu và ung thư biểu mô tương tự như hoạt tính của hợp chất Dioncoquinones A và B trên tế bào u tủy. Tuy nhiên, do đánh giá hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư khác nhau, nên chưa có những so sánh cụ thể về hoạt tính nhóm hợp chất alkaloid từ loài A. cochinchinensis của Việt Nam và các loài khác trên thế giới. Bên cạnh khả năng tiêu diệt tế bào gây bệnh, khả năng không gây độc với các tế bào bình thường của hợp chất AC5 cũng cần phải được nghiên cứu sâu hơn. Thành phần hóa học của cây Trung quân khá đa dạng, trong đó alkaloid là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học rõ rệt nhất với hơn 140 dạng khác nhau [17]. Đặc biệt hợp chất dimeric naphthylisoquinon alkaloids hay còn gọi là michellamines B có khả năng ức chế sự sinh trưởng của virus gây suy giảm miễn dịch ở người HIV ở mức độ in vivo [45].
Hiện nay, khai thác và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên, đặc biệt là các cây dược liệu tại Việt Nam đang là mối quan tâm đồng thời của các nhà nghiên cứu và quản lý. Thực tế đã cho thấy rất nhiều các thuốc cũng như thực phẩm chức năng được phát triển từ những hợp chất thiên nhiên có trong cây dược liệu chẳng hạn như taxol chữa ung thư, curcumin kháng khuẩn, chống oxy hóa và đặc hiệu với các bệnh viêm loét dạ dày. Chứa nhiều hợp chất tiềm năng, thành phần hóa học của cây Trung quân ở Việt Nam cũng đã được một số nhóm nghiên cứu và khẳng định vai trò của nhóm hợp chất alkaloid từ loài cây này.Với nguyên liệu thí nghiệm là sáu hợp chất phân lập
từ loài A. cochichinenis (Vĩnh Phúc), đề tài đã xác định được khả năng gây độc lên ba 3 nhóm tế bào ung thư phổi, ung thư vú và ung thư biểu mô của hợp chất 4’-methoxy-5-epi-ancistecrorine A1 thuộc nhóm alkaloid. Bên cạnh đó, hai hợp chất anciscohine 6-0-β-D-glucopyranoside (nhóm alkaloid) và tortoside A (nhóm phenolic) cũng thể hiện khả năng ức chế sự sinh trưởng của 3 nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột là E. coli, S. aureus và S. typhimurium. Những kết quả nghiên cứu trên đây đã bước đầu khẳng định giá trị của loài Trung quân A. cochichinenis tại Việt Nam, cũng như cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng lá Trung quân trong các bài thuốc dân gian trị bệnh tại địa phương.
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Hoạt tính kháng sinh
Sáu hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis được sử dụng trong nghiên cứu đều thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của ít nhất một trong ba loại vi khuẩn kiểm định là E. coli, Staphylococcus aureus và Salmonella typhymurium. Hai hợp chất AC2 và AC4 đều có khả năng ức chế cả ba vi khuẩn, trong đó hợp chất AC4 thể hiện hoạt tính tốt hơn. Hợp chất AC1, AC3 và AC5 có khả năng ức chế hai vi