3. Nội dung nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất được phân lập từ chi Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis bằng phương pháp khuếch tán giếng trên đĩa thạch (agar well diffusion method) theo Hadacek và đồng tác giả (2000), Trần Mỹ Linh và đồng tác giả (2013) [8], [31] gồm các bước sau:
Chủng vi sinh vật sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc (đối với vi khuẩn) hoặc môi trường Hansen (đối với nấm), một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường lỏng tương ứng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C (đối với vi khuẩn) hoặc 250C (đối với vi nấm). Vi khuẩn được nuôi phục hồi bằng cách nuôi 0,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm trong 12,5 ml môi trường LB lỏng trong vòng 3 giờ đến khi giá trị đo OD600 dung dịch nuôi khuẩn bằng 0,8.
Sau đó, đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 µl dịch vi sinh vật (OD600 = 0,4 - 0,5) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường đặc, để khô và đục 5-6 giếng đường kính 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2- 3 cm.
Dịch chiết thử được chuẩn bị bằng cách hòa tan chất bột đã tinh chế được trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) thành các nồng độ theo yêu cầu. Tiếp đó, bổ sung 50 µl dịch chiết thử, đối chứng dương, đối chứng âm vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy; sau đó đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 16-18 h (đối với vi khuẩn) hoặc 250C trong 48h (đối với nấm).
Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh Kanamycin 0,1 mg/ml đối với 3 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, dung dịch kháng nấm Ciclopiroxolamine 1 mg/ml Candida albicans và A. fumigatus. Đối chứng âm là DMSO.
Hoạt tính ức chế sinh vật được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:
BK (mm) = D-d
Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị BK trung bình.