TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

4. Những điểm mới của đề tài Error! Bookmark not defined.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

Năm 1938, Seegers và cô ̣ng sƣ̣ đã tinh sa ̣ch đƣợc thrombin với hoa ̣t tính 600 U/mg, xác định thrombin bị mất hoạt tính bắt đầu ở pH 4,1 còn prothrombin không hoa ̣t đô ̣ng bắt đầu ở pH 4,8 và cả thrombin và prothrombinđều mất hoạt tính hoàn toàn ở pH 3,5 và acid nitro làm mất hoạt tính của cả prothrombin và thrombin.

Năm 1971, Markland và Damus đã tinh sa ̣ch đƣợc thrombin tƣ̀ rắn

Crotalus adamanteus vớ i khối lƣợng phân tƣ̉ 32,7 kDa, hoạt động với pH tối ƣu gần pH8 và ổn đi ̣nh ở pH trung tính và kiềm nhƣng mất hoa ̣t tính với pH acid . Hơn thế nƣ̃a tác giả cũng đã nghiên cƣ́u đƣợc tầm quan tro ̣ng của cầu disulfua tới cấu trúc của enzyme đƣợc xác đi ̣nh bởi sƣ̣ mất hoa ̣t tính nhanh chóng khi có

-mercaptoethanol.

Cũng trong năm 1971, Geogre glover và Elliott shaw đã tinh sa ̣ch đƣợc thrombin của bò sƣ̉ du ̣ng mô ̣t số cô ̣t sắc ký nhƣ sắc ký lo ̣c gel Sephadex G 75, cô ̣t trao đổi ion Bio -Rex 70 và Rexyn 102 H+

vớ i hoa ̣t tính đông đa ̣t 2100 đến 2500 NIH/mg.

Năm 1977, Fenton John W. và cộng sự đã sản xuất , đánh giá và xác đi ̣nh đƣợc tính chất của -thrombin củ a ngƣời với hoa ̣t tính đông đa ̣t 2,8  0,4 (NIH) units/g. Thrombin đƣợc bảo quản ở 4°C trong khoảng 1 tuần, hơn 1 năm ở - 50°C và và thrombin đã đông khô vẫn giƣ̃ đƣợc hoa ̣t tính trong 1 năm khi bảo quản ở 4°C.

Năm 1991, Naski và cô ̣ng sƣ̣ đã tinh sa ̣ch đƣợc thrombin sƣ̉ du ̣ng cô ̣t heparin sepharose CL-6B vớ i đô ̣ sa ̣ch đa ̣t hơn 97% và hoạt tính đạt 4000 U/mg.

Năm 2007, thrombin đã đƣợc tinh sa ̣ch tƣ̀ huyết tƣơng ngƣời . Prothrombin đƣợc tách chiết và tinh sa ̣ch qua cô ̣t DEAE , heparin sau đó tiếp tu ̣c qua cô ̣t DEAE lần 2 rồi qua cô ̣t sắc ký ái lƣ̣c (IMAC), cuối cùng prothrombin đƣợc chuyển hóa thành thrombin và tinh sa ̣ch qua cô ̣t tƣơng tác ky ̣ nƣớc (HIC). Thrombin đã đƣợc tinh sa ̣ch với đô ̣ sa ̣ch đa ̣t 75%, hoạt tính xấp xỉ 2 400 IU/mg protein.

Năm 2012, Ghorbanpour đã tinh sa ̣ch đƣợc thrombin tƣ̀ no ̣c rắn bằng viê ̣c sƣ̉ du ̣ng cô ̣t sắc ký lo ̣c gel sephadex G 50, cô ̣t trao đổi ion DEAE -Sepharose và cô ̣t HPLC C 18 với hoa ̣t tính riêng đa ̣t 721,2 (mol/min/mg). Thrombin tƣ̀ no ̣c rắn có khối lƣợng phân tƣ̉ khoảng 30,5 kDa và hoa ̣t tính đa ̣t cao nhất ta ̣i 37°C và pH 7,5.

Năm 2014, Zaqueo và cô ̣ng sƣ̣ đã tách đƣợc mô ̣t thrombin mới tƣ̀

Bothrops pirajai của rắn có nọc độc bằng việc sử dụng ba cột sắc ký (sắc ký lo ̣c gel, sắc ký ái lƣ̣c và sắc ký pha ngƣợc ) với kích thƣớc khoảng 39,4 kDa. Cũng trong năm này, Wood và cô ̣ng sƣ̣ đã đã xác đi ̣nh ảnh hƣởng của sƣ̣ ta ̣o thành - thrombin thông qua prothrombinase , phƣ́c hợp của các yếu tố Va và Xa phu ̣ thuô ̣c vào Ca2+

trên bề mặt tiểu cầu hoa ̣t đô ̣ng.

Đặc biệt hiện nay có một số các patent về sản xuất tinh sạch thrombin của Mỹ ví dụ nhƣ patent có mã số US2006/0270014A1 của Pawlak và cộng sự (2006) tinh sạch thrombin từ phổi bò qua một số các bƣớc cơ bản nhƣ chiết với muối 0,05 M NaCl 12- 72 giờ ở 0-15°C, sau đó dịch chiết đƣợc loại tủa với 50% Mg(OH)2, tủa protein bằng muối ammonium sulfate , thẩm tích và qua một số các cột trao đổi ion hay cột sắc ký lọc gel . Thrombin tinh sạch thu đƣợc có độ sạch đạt 98%. Hay pantent có mã số US 2011/13099087 của Overholser và cộng sƣ̣ (2012) đã sƣ̉ du ̣ng mô ̣t số chất hay dung môi để tủa fibrinogen và loa ̣i

fibrinogen trong máu và đƣợc ủ với Ca2+