Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nha- 123docz.net

CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.3. Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau

* Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau

Mẫu phổi thu thập được được rửa sạch với nước cất rồi sau đó rửa lại với nước muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi được giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn, ngâm mẫu 24h trong điều kiện 4C. Mẫu được ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu dịch. Dịch được tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó được ly tâm

4000 rpm trong 5 phút, thu dịch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% ở điều kiện 4C, 37C, 45C và 60C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa . Tủa được hòa tan trong NaCl 0,05M. Lặp lại thí nghiệm tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% ở các điều kiện nhiệt độ n hư trên. Dịch thu được bổ sung CaCl2 0,6M đạt nồng độ 30 mM.

* Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; với mẫu đối chứng không sử dụng thrombin . Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

* Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổi anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái l ực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

* Sắc ký lọc gel Biogel P100

Là cột phân tách hỗn hợp protein theo nguyên tắc lọc gel . Biogel P100 là mô ̣t polyacrylamide trong đó phân tƣ̉ của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang ta ̣o thành sàng phân tƣ̉ bởi hê ̣ thống lỗ lƣới xốp . Dƣ̣a vào sƣ̣ khác nhau về kích thƣớc và phân tƣ̉ lƣợng của các protein có trong hỗn hợp để phân tách.

Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml.

* Điện di SDS-PAGE

Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch protein đƣợc đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide.

* Xác định hàm lƣợng protein

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo Bradford.

Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau

Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN