Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau

CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.4. Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau

* Tách thrombin pH khác nhau

Mẫu phổi thu thập được được rửa sạch với nước cất rồi sau đó rửa lại với nước muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi được giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn, ngâm mẫu khoảng 24 giờ trong điều kiện 4C. Mẫu được ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu dịch. Dịch được tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó được ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu dịch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% để -20C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa . Tủa được hòa tan trong dung di ̣ch đệm Na- acetate 100 mM (pH 4,5 - 6), Na-phosphate 100 mM (pH 6,5 - 7,5), Tris-HCl (pH 8,0 - 8,5) với bƣớc nhảy pH là 0,5. Lặp la ̣i thí nghiê ̣m nhƣ trên và hòa tan

tủa trong dung dịch đệm tƣơng ứng. Dịch thu được bổ sung CaCl2 0,6 M đạt nồng độ 30 mM.

* Tinh sạch thrombin

- Sắc ký trao đổi ion DEAE

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổi anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá, khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái lƣ̣c ma ̣nh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

Cột DEAE được rửa với nước, sau đó được cân bằng với đệm Tris- HCl 0,05M pH 8 và NaCl 0,05 M bằng 3 lần thể tích cột. Mẫu được nạp lên cột tinh sạch và thôi bằng đệm Tris -HCl 0,05M pH 8 và NaCl 1M. - Sắc ký ái lực Ni2+-NTA

Các phân đoạn được thu sau khi qua cột DEAE tiếp tục được đưa lên cột Ni-NTA sử dụng đệm gắn cột (Tris-HCl 0,01M pH8; NaCl 0,5M; imidazole 10mM). Sau đó cột được rửa với đệm rửa (Tris-HCl 0,01M pH8; NaCl 0,5M; imidazole 35mM) và được thôi bằng dung dịch đệm chứa muối 250 mM imidazole.

* Điện di SDS-PAGE

nồng độ 12,5% theo phƣơng pháp điện di biến tính (Laemmli, 1970). * Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; với mẫu đối chứng (-) không sử dụng thrombin và mẫu đối chứng (+) là thrombin được tách trong NaCl 0,05M. Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN