KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát hoạt tính của thrombin ở một số mẫu phổi bò đƣợc thu thập ở các vùng khác nhau.

Prothrombin đƣợc tách chiết tƣ̀ các mẫu phổi bò có kích thƣớc khoảng 72 kDa (Hình 3.1). Kết quả điê ̣n di đồ cho thấy rằng protein tách chiết tƣ̀ các mẫu phổi bò thu thập từ các vùng Đông Anh, Vĩnh Phúc gần nhƣ không có sƣ̣ khác biê ̣t gì.

1 2 3 M kDa 66 45 35 25 18 1 2 3 4 5 6 M kDa 66 45 35 25 18 A B

Hình 3.1. Điện di đồ SDS-PAGE. (A) mẫu protein thrombin tách chiết tƣ̀ mẫu phổi bò; (B) mẫu protein thrombin tinh sạch qua cột Nikel (1: mẫu

lên cột; 2: mẫu tủa dung môi ethanol; 3-6: mẫu protein thu đƣợc ở các phân đoạn 1-4).

Kết quả hình 3.1 B cho thấy, chúng tôi đã tinh sạch đƣợc prothrombin sau khi cho mẫu qua cột nikel, prothrombin có khối lƣợng phân tử là 72 kDa.

Prothrombin sau đó đƣợc chuyển hóa thành thrombin bởi Ca 2+

và đƣợc đánh giá hoa ̣t tính bằng phƣơng pháp xác đi ̣n h thời gian đông của fibrinogen . Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy , thrombin tách tƣ̀ mẫu phổi bò đều có hoa ̣t tính chuyển hóa fibrinogen thành fibin làm mẫu đôn g la ̣i (Hình 3.1). Tƣ̀ đó cho thấy, các mẫu phổi bò đều chứa prothrombin (prothrombin đƣợc chuyển hóa thành thrombin ở da ̣ng hoa ̣t đô ̣ng khi bổ sung với Ca2+

* Khảo sát hoạt tính thrombin

Thrombin đƣợc tách tƣ̀ phổi bò đều có hoa ̣t tính ma ̣nh với thời gian đông khoảng 25 phút và có hoạt tính tốt hơn thrombin tách tƣ̀ máu bò với gian đông 40 phút. Và một điều đặc biệt là khi tách thrombin từ mẫu phổi bò sẽ an toàn hơn khi tách từ mẫu máu bò, nguy cơ lây nhiễm sẽ thấp hơn.

A B C

Hình 3.2. Khảo sát hoạt tính của thrombin của các mẫu phổi bò khác nhau (A: 5 mẫu phổi lần 1; B: 5 mẫu phổi bò đợt 2; C: 5 mẫu phổi bò đợt 3)

Kết quả hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy dựa vào thời gian đông, màu sắc của fibrin cho thấy thrombin tách ra từ phồi bò có khả năng chuyển hóa fibrinogen thành fibrin mạnh.

3.2. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò 3.2.1. Tách thrombin ở nồng độ ethanol khác nhau 3.2.1. Tách thrombin ở nồng độ ethanol khác nhau

3.2.1.1. Tách thrombin ở nồng độ ethanol khác nhau

Prothrombin đƣợc tách tƣ̀ mẫu phổi bò bằng cách sƣ̉ du ̣ng ethanol tuyê ̣t đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ( Hình 3.3). Kết quả điê ̣n di đồ cho thấy rằng prot ein tách ở nồng đô ̣ ethanol đa ̣t 20% có sự khác biệt đáng kể so với ở nồng đô ̣ 30% tới 60%. Trong khi, prothrombin đƣợc tách với ethanol đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 30% và 40% không có sƣ̣ khác biê ̣t đáng kể cũng nhƣ ở nồng độ 50% và 60%.

1 2 3 4 5 kDa  150  75  50  37  15

Hình 3.3. SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổi bò sƣ̉ du ̣ng ethanol đa ̣t nồng đô ̣ 20% (1), 30% (2), 40% (3), 50% (4), 60% (5)

3.2.1.2. Tinh sạch thrombin

Mẫu protein sau khi đƣợc tách chiết sơ bộ có sử dụng ethanol ở nồng độ 50-60% đƣợc tiếp tục qua các cột sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. Kết quả trên hình 3 đã cho thấy prothrombin khá tinh sạch, với một băng protein có kích thƣớc khoảng 72 kDa, tuy nhiên vẫn còn một số băng phụ.

kDa 66  45 35  25 18 1 2 3 M 4 5 6 7 8 kDa 72

Hình 3.4 Điện di đồ protein prothrombin tách chiết từ phổi bò (A); protein prothrombin sau khi tinh sạch (1-8: các phân đoạn tinh sạch thu

prothrombin)

Hình 3.5 Khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin (ĐC: Đối chứng; 1-5: Thrombin tá ch với ethanol đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 20%, 30%, 40%,

50 % và 60%, tƣơng ƣ́ ng)

Prothrombin sau đó đƣợc chuyển hóa thành thrombin bởi Ca 2+

và đƣợc đánh giá hoa ̣t tính bằng phƣơng pháp xác đi ̣nh thời gian đông của fibrinogen . Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy , thrombin tách với ethanol đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 20% có hoạt tính tốt nhất . Khi sƣ̉ du ̣ng ethanol tách ở nồng đô ̣ càng cao thì hoạt tính chuyển hóa fibrinogen càng giảm.

Bảng 1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol trong quá trình tách tới hoạt tính thrombin

Nồng đô ̣ ethanol (%) 20 30 40 50 60

Thời gian chuyển hóa

fibrinogen (phút) 15 45 45 60 60

Kết quả trên điện di đồ trên SDS-PAGE cho thấy đã thu đƣợc một băng protein có khối lƣợng 37 kDa khá đậm, một số băng phụ vẫn xuất hiện khi tiến hành chuyển hóa prothrombin sang dạng hoạt động thrombin (Hình 3.6). Tuy nhiên đây chỉ là những nghiên cứu ban đầu tìm điều kiện tách chiết thrombin từ phổi bò có sử dụng ethanol.

kDa

66 45 35  25 18 14  1 M 2 3

Hình 3.6 Điện di đồ protein thrombin sau khi đƣợc chuyển hóa từ prothrombin sử dụng 30 mM CaCl2

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số các kết quả nghiên cứu trên thế giới . Năm 1962, Doolittle và cô ̣ng sƣ̣ đã tách fibrinogen bằng tủa với ethanol 10% ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ còn prothrombin đã đƣợc tách bằng cách tủa vớ i ethanol 20%. Ngoài ra, Qiu và cô ̣ng sƣ̣ (2003) cũng đã loại fibrinogen bằng việc xử lý với ethanol ở nồng độ 100 ml/L ở nhiêt độ 4C, 15 phút.

Một số các phƣơng pháp tinh sạch thrombin cũng đang đƣợc sử dụng ở một số nghiên cứu nhƣ Aizawa và cộng sự (2007) chứng minh thrombin đã đƣợc tinh sạch từ huyết tƣơng ngƣời . Prothrombin đƣợc tách chiết và tinh sa ̣ch qua cô ̣t DEAE, heparin sau đó tiếp tu ̣c qua cô ̣t DEAE lần 2 rồi qua cô ̣t sắc ký ái lƣ̣c (IMAC), cuối cù ng prothrombin đƣợc chuyển hóa thành thrombin và tinh sa ̣ch qua cô ̣t tƣơng tác ky ̣ nƣớc (HIC).

3.2.2.Tách prothrombin ở nồng độ acetone khác nhau

3.2.2.1. Tách prothrombin ở nồng độ acetone khác nhau

Prothrombin đƣợc tách tƣ̀ mẫu phổi bò bằng cách sƣ̉ du ̣ng acetone tuyê ̣t đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ( Hình 3.7). Kết quả điê ̣n di đồ cho thấy rằng protein tách ở nồng đô ̣ acetone đa ̣t 20% tới 40% không có sự khác biệt đáng kể . Trong khi, acetone đạt nồng đô ̣ 50% và 60% xuất hiê ̣n nhiều băng đâ ̣m có kích thƣớc khoảng tƣ̀ 50 kDa tới 75 kDa.

1 2 3 4 5 M kDa  150  75  50  37  15

Hình 3.7 SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổi bò sƣ̉ du ̣ng acetone đa ̣t nồng đô ̣ 20% (1), 30% (2), 40% (3), 50% (4) và 60% (5).

3.2.2.2. Tinh sạch thrombin

Mẫu protein sau khi đƣợc tách chiết sơ bộ có sử dụng acetone ở nồng độ 50-60% đƣợc tiếp tục qua các cột sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. Kết quả trên hình 3.8 đã cho thấy prothrombin khá tinh sạch với một băng protein có kích thƣớc khoảng 72 kDa. kDa 66  45 35  25 18 M 1 2 3 4 5 kDa 72

Hình 3.8 Điện di đồ protein prothrombin tách chiết từ phổi bò (A); protein prothrombin sau khi tinh sạch (1-5: các phân đoạn tinh sạch thu

prothrombin).

3.2.2.3. Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Prothrombin sau đó đƣợc chuyển hóa th ành thrombin bởi Ca 2+

và đƣợc đánh giá hoa ̣t tính bằng phƣơng pháp xác đi ̣nh thời gian đông của fibrinogen và điện di trên gel polyacrylamide 12,5%. Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy , thrombin tách với acetone đạt nồng độ 50% có hoạt tính tốt nhất.

Hình 3.9 Khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin (ĐC: Đối chƣ́ng; 1-5: thrombin tách với acetone đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 20%,

30%, 40%, 50 % và 60%, tƣơng ƣ́ ng).

Prothrombin sau đó đƣợc chuyển hóa thành thrombin bởi Ca2+

và đƣợc đánh giá hoa ̣t tính bằng phƣơng pháp xác đi ̣nh thời gian đông của fibrinogen . Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy , thrombin tách với acetone đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 50% có hoạt tính tốt nhất . Khi sƣ̉ du ̣ng acetone tác h ở nồng đô ̣ dƣới 50% và trên 50% thì hoạt tính chuyển hóa fibrinogen càng giảm (Bảng 1).

Bảng 1. Ảnh hƣởng của nồng độ acetone trong quá trình tách tới hoạt tính thrombin

Nồng đô ̣ acetone (%) 20 30 40 50 60

Thời gian chuyển hóa

fibrinogen (phút) 30 30 30 25 35

Hình ảnh điện di đồ trên SDS-PAGE cho thấy đã thu đƣợc một băng protein có khối lƣợng 37 kDa khi tiến hành chuyển hóa prothrombin sang dạng hoạt động thrombin (Hình 3.10) kDa 66 45 35  25 18 14  1 M 2 3

Hình 3.10 Điện di đồ protein thrombin sau khi đƣợc chuyển hóa từ prothrombin sử dụng 30 mM CaCl2

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số các nghiên cứu trên thé giới . Theo Seegers và cô ̣ng sƣ̣ (1958) đã tách thrombin bằng tủa với acetone đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 50% và đã tinh sạch đƣợc thrombin với hoạt tính đạt 4100 U/mg khối lƣợng khô và thrombin vẫn giƣ̃ đƣợc hoạt tính khoảng 70% sau 20 tuần bảo quả ở 4C

3.2.3. Tách thrombin ở điều kiện nhiệt độ khác nhau

kDa M 1 2 3 4 150  75  50  37  15 

Hình 3.11 SDS-PAGE protein tách tƣ̀ mẫu phổi bò ở 4C (1), 37C (2), 45C (3) và 60C (4)

Prothrombin đƣợc tách tƣ̀ mẫu phổi bò ở các điều kiê ̣n nhiê ̣t đô ̣ 4C, 37C, 45C và 60C (Hình 3.11). Kết quả điê ̣n di đồ cho thấy rằng protein tách ở điều kiê ̣n nhiê ̣t đô ̣ khác nhau có sƣ̣ khác biê ̣t rõ rê ̣t . Trong đó, prothrombin đƣợc tách ở 45C và 60C hầu nhƣ mô ̣t số protein với kích thƣớc nhỏ hơn 50 kDa đều có hàm lƣợng thấp so với prothrombin đƣợc tách ở 4C và 37C.

Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy , thrombin tách ở điều kiê ̣n 600

C có hoa ̣t t ính tốt nhất. Tuy nhiên, ở điều kiện nhiệt độ càng cao với thời gian dài có thể làm ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme . Do vâ ̣y để đảm bảo không ảnh hƣởng tới hoạt tính của thrombin thì điều kiện tách tốt nhất là ở 4o

C đến 8oC.

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ trong quá trình tách tới hoạt tính thrombin

Nhiê ̣t đô ̣ 4C 37C 45C 60

Thời gian chuyển hóa fibrinogen (phút)

15 15 10 20

Vì vậy, nhiệt độ tối ƣu trong tách chiết thrombin là ở 4oC đến 8oC. 3.2.4. Tách thrombin ở cách ngƣỡng pH khác nhau

Prothrombin được tách từ mẫu phổi bò sƣ̉ du ̣ng đệm Na-acetate 100 mM (pH 4,5-6), Na-phosphate 100 mM (pH 6,5-7,5), Tris-HCl (pH 8,0-8,5) với bƣớc nhảy pH là 0,5. Kết quả điê ̣n di đồ cho thấy không có sƣ̣ khác biê ̣t khi tách ở điều kiện pH khác nhau so với tách khi sử dụng NaCl (Hình 3.12).

1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 kDa  100  75  50  37  25 15

Hình 3.12 SDS-PAGE protein tách từ mẫu phổi bò ở pH khác nhau (1- 3: đệm Na-acetate 100 mM ở pH 5,0 pH 5,5, pH 6,0; 4-6: Đê ̣m Na- phosphate 100 mM ở pH 6,5, pH 7,0 và pH 7,5; 7-8: Đê ̣m Tris-HCl ở pH

8,0 và pH 8,5; 9: NaCl)

Kết quả nghiên cứu cho thấy, thrombin tách sử dụng đệm tại pH 4,5 và pH 6,5 tới pH 7,5 khi đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen mẫu bị tủa trắng . Tại pH 8, thrombin cũng có hoạt tính chuyển hóa thấp

còn tại pH 8,5 thrombin có hoạt tính tốt nhất . Điều đó cho thấy , tại điều kiện pH thấp làm mất hoạt tính của thrombin và khi sử dụng đệm Na - phosphate cũng làm ảnh hƣởng tới hoa ̣t tính thrombin.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH trong quá trình tách tới hoạt tính thrombin

pH 4,5 5, 0 5, 5 6, 0 6, 5 7, 0 7, 5 8, 0 8, 5 Đc (+) Thời gian chuyển hóa

fibrinogen (phút) Bị tủa N G N G N G Bị tủ a Bị tủ a Bị tủ a 12 0 12 12

NG: không xác định

Vì vậy, pH tối ƣu trong tách chiết thrombin là 8,5.

3.2.5. Tách thrombin với các ngƣỡng thời gian ngâm tách mẫu khác nhau

Prothrombin được tách từ mẫu phổi bò được ngâm ở các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (Hình 3.13). Kết quả điện di đồ cho thấy rằng protein tách ở thời gian ngâm mẫu khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Trong đó, prothrombin được tách khi ngâm mẫu trong 12 giờ hầu như một số protein với kích thước nhỏ hơn 60 kDa đều có hàm lượng rất thấp so với prothrombin được tách ở thời điểm ngâm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Ở thời điểm ngâm 72 giờ không có sự khác biệt đáng kể so với khi ngâm mẫu 48 giờ.

kDa M 1 2 3 4 150  75  50  35  15 

Hình 3.13 SDS-PAGE protein tách từ mẫu phổi bò khi ngâm mẫu 12 giờ (1), 24 giờ (2), 48 giờ (3) và 72 giờ (4)

Kết quả nghiên cứu cho thấy , thrombin tách ở điều kiện khi ngâm khoảng 12 giờ và 24 giờ có hoạt tính tốt hơn so với khi ngâm mẫu 48 giờ và 72 giờ. Do vậy, có thể ngâm mẫu ở thời điểm từ 12 giờ tới 24 giờ để tách protein. Hơn nữa, khi ngâm mẫu ở thời gian quá lâu có thể làm vi sinh vật phát triển ảnh hưởng tới hoạt tính của thrombin.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm tách mẫu trong quá trình tách tới hoạt tính thrombin

Thời gian chuyển hóa fibrinogen (phút)

15 15 20 20

Vì vậy, thời gian ngâm tách mẫu tối ƣu trong tách chiết thrombin từ phổi bò là từ 12 giờ đến 24 giờ.

3.3. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò

Sau khi xác định đƣợc điều kiện tối ƣu để tách chiết thrombin với điều kiện pH 8,5 , thời gian ngâm tách mẫu 12 giờ đến 24 giờ, nhiệt độ 4oC đến 8o

C, nồng độ aceton 50%, nồng độ ethanol 20% chúng tôi xây dựng đƣợc quy trình tách chiết thrombin nhƣ sau:

Phổi bò

Rửa bằng nƣớc cất NaCl 0,05 M

Ethanol Aceton Nhiệt độ

20 30 40 50 60 20 30 40 50 60 4oC 37oC 45oC 60OC

15 45 45 60 60 30 30 30 25 35 15 15 10 20

THỜI GIAN CHUYỂN HÓA FIBRINOGEN CỦA THROMBIN (PHÖT)

Tủa NG NG NG Tủa Tủa Tủa 12 12 12 15 15 20 20

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 ĐC (+) 12 24 48 72

pH Thời gian ngâm mẫu (giờ)

3.4. Kết quả nghiên cứu bổ sung các chất an định (bền) cấu trúc của thrombin và tannic acid ở điều kiện môi trƣờng thƣờng thrombin và tannic acid ở điều kiện môi trƣờng thƣờng

3.4.1. Đánh giá ảnh hƣởng của các chất an định đối với acid tannic và thrombin thrombin

Hình 3.15 Khảo sát khả năng chuyển hóa fibrionogen của thrombin và acid tannic (ĐC (-): không có thrombin; ĐC (+): thrombin; 1-2: acid tannic 0,05%)

Kết quả cho thấy, mặc dù hàm lƣợng acid tannic cũng sử dụng là 0,05% nhƣng khi thực hiện phản ứng chuyển hóa thì khả năng chuyển hóa ít hầu nhƣ không xuất hiện khả năng chuyển hóa fibrinogen thành fibrin. Nhƣ vậy, việc đánh giá chất an định với acid tannic trong sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin là không cần thiết.

3.4.2. Ảnh hƣởng của các chất an định đối với thrombin

Thời gian đông của mẫu đối chứng: 2 phút (ban đầu và 8 giờ), không đông (24 giờ) Bảng 3.7. Đánh giá các chất an định đến đối với thrombin

Chất Thời gian Nồng độ các chất trong thrombin

0,05% 0,1% 0,5% 1% 2% 5%

Tween 20 Ban đầu 5 5 5 7 7 7

8h 5 5 5 5 5 5

24h 25 25* 20* 20 120* 120*

Tween 80 Ban đầu 7 7 7 120 NG NG

8h 7 15* 15* 120 NG NG

24h NG 120 30 120* NG NG

Trixton X100 Ban đầu 2 2 2 2 2 2

8h 2 2 2 2 2 2

PEG 4000 Ban đầu 2 2 2 2 2 2 8h 2 2 2 2 2 2 24h NG 75 NG NG NG NG SDS Ban đầu 60 NG NG NG NG NG 8h 60* NG NG NG NG NG 24h NG NG NG NG NG NG

* Kém; T tủa; NG không đông

Kết quả nghiên cứu cho thấy, tại thời điểm sau 8 giờ, khi bổ sung một số chất nhƣ Tween 20, TrixtonX100, PEG 4000 không có ảnh hƣởng đáng kể so với mẫu đối chứng. Trong khi sử dụng Tween 80 và SDS làm ảnh hƣởng tới hoạt tính thrombin, hoạt tính chuyển hóa fibrinogen thành fibrin bị giảm đáng kể.

Sau 24 giờ, thrombin bổ sung thêm tween 20 tại nồng độ 0,5% đến 1%, hoạt tính vẫn còn so với mẫu đối chứng.

Ảnh hưởng của chất Tween 20

A B

Hình 3.9. Ảnh hưởng của Tween 20 đối với thrombin ở thời điểm ban đầu (A), sau 8 giờ (B) và sau 24 giờ (C); ĐC(-): không thrombin; ĐC(+): có thrombin Ảnh hưởng của chất Tween 80

A B

Hình 3.10. Ảnh hưởng của tween 80 đối với thrombin ở thời điểm ban đầu (A), sau 8 giờ (B) và sau 24 giờ (C) ĐC(-): không thrombin; ĐC(+): có thrombin

Ảnh hưởng của chất Triton X100

Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau