Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi b- 123docz.net

CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò

2.2.2.1. Tách thrombin ở nồng độ ethanol khác nhau

Mẫu phổi thu thâ ̣p đƣợc đƣợc rƣ̉a sa ̣ch với nƣớc cất rồi sau đó rƣ̉a la ̣i với nƣớc muối NaCl 0,05 M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi đƣợc giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05 M, xay nhuyễn, ngâm mẫu 24 giờ trong điều kiê ̣n 4C. Mẫu đƣợc ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu di ̣ch. Dịch đƣợc tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó đƣợc ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu di ̣ch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20%, 30%, 40%, 50%, 60% để -20C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa. Tủa đƣợc hòa tan trong NaCl 0,05 M. Lă ̣p la ̣i thí nghiê ̣m tủa với ethanol tuyê ̣t đối để đa ̣t nồng đô ̣ ethanol cuối cùng nhƣ trên . Dịch thu đƣợc bổ sung CaCl2 0,6 M đạt nồng đô ̣ 30 mM.

* Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu đƣợc khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ƣ́ng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; vớ i mẫu đối chƣ́ng không sƣ̉ du ̣ng thrombin . Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

*Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổi anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣ t, các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái lƣ̣c ma ̣nh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

*Sắc ký lọc gel Biogel P100

Là cột phân tách hỗn hợp protein theo nguyên tắc lo ̣c gel . Biogel P100 là mô ̣t polyacrylamide trong đó phân tƣ̉ của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang ta ̣o thành sàng phân tƣ̉ bởi hê ̣ thống lỗ lƣới xốp . Dƣ̣a vào sƣ̣ khác nhau về kích thƣớc và phân tƣ̉ lƣợng của các protein có trong hỗn hợp để phân tách.

Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml.

*Điện di SDS-PAGE

Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch protein đƣợc đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide.

*Xác định hàm lƣợng protein

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo Bradford.

2.2.2.2. Tách thrombin ở nồng độ aceton khác nhau

*Tách thrombin ở nồng độ acetone khác nhau

Mẫu phổi thu thâ ̣p đƣợc đƣợc rƣ̉a sa ̣ch với nƣớc cất rồi sau đó rƣ̉a la ̣i với nƣớc muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi đƣợc giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn, ngâm mẫu 24 giờ trong điều kiê ̣n 4C. Mẫu đƣợc ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu di ̣ch. Dịch đƣợc tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó đƣợc ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu di ̣ch, tiếp tu ̣c bổ sung acetone tuyê ̣t đối để đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 20%, 30%, 40%, 50%, 60% để -20C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa. Tủa đƣợc hòa tan trong NaCl 0,05 M. Lă ̣p la ̣i thí nghiê ̣m tủa với acetone tuyê ̣t đối để đ ạt nồng độ acetone cuối cùng nhƣ trên . Dịch thu đƣợc bổ sung CaCl2 0,6 M đạt nồng đô ̣ 30 mM.

*Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

*Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ứng trao đổi anion giữa protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc

đẩy khỏi cô ̣t bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

*Sắc ký lọc gel Biogel P100

Là cột phân tách hỗn hợp protein theo nguyên tắc lọc gel . Biogel P100 là mô ̣t polyacrylamide trong đó phân tƣ̉ của chúng l iên kết với nhau bởi các liên kết ngang ta ̣o thành sàng phân tƣ̉ bởi hê ̣ thống lỗ lƣới xốp . Dƣ̣a vào sƣ̣ khác nhau về kích thƣớc và phân tƣ̉ lƣợng của các protein có trong hỗn hợp để phân tách.

Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml.

* Điện di SDS-PAGE

Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch protein đƣợc đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide.

* Xác định hàm lƣợng protein

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo Bradford.

2.2.2.3. Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau

* Tách chiết thrombin ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau

Mẫu phổi thu thập được được rửa sạch với nước cất rồi sau đó rửa lại với nước muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi được giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn, ngâm mẫu 24h trong điều kiện 4C. Mẫu được ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu dịch. Dịch được tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó được ly tâm

4000 rpm trong 5 phút, thu dịch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% ở điều kiện 4C, 37C, 45C và 60C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa . Tủa được hòa tan trong NaCl 0,05M. Lặp lại thí nghiệm tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% ở các điều kiện nhiệt độ n hư trên. Dịch thu được bổ sung CaCl2 0,6M đạt nồng độ 30 mM.

* Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; với mẫu đối chứng không sử dụng thrombin . Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

* Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổi anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái l ực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

* Sắc ký lọc gel Biogel P100

Là cột phân tách hỗn hợp protein theo nguyên tắc lọc gel . Biogel P100 là mô ̣t polyacrylamide trong đó phân tƣ̉ của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang ta ̣o thành sàng phân tƣ̉ bởi hê ̣ thống lỗ lƣới xốp . Dƣ̣a vào sƣ̣ khác nhau về kích thƣớc và phân tƣ̉ lƣợng của các protein có trong hỗn hợp để phân tách.

Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml.

* Điện di SDS-PAGE

Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch protein đƣợc đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide.

* Xác định hàm lƣợng protein

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo Bradford.

2.2.2.4. Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau

* Tách thrombin pH khác nhau

Mẫu phổi thu thập được được rửa sạch với nước cất rồi sau đó rửa lại với nước muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi được giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn, ngâm mẫu khoảng 24 giờ trong điều kiện 4C. Mẫu được ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu dịch. Dịch được tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó được ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu dịch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% để -20C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa . Tủa được hòa tan trong dung di ̣ch đệm Na- acetate 100 mM (pH 4,5 - 6), Na-phosphate 100 mM (pH 6,5 - 7,5), Tris-HCl (pH 8,0 - 8,5) với bƣớc nhảy pH là 0,5. Lặp la ̣i thí nghiê ̣m nhƣ trên và hòa tan

tủa trong dung dịch đệm tƣơng ứng. Dịch thu được bổ sung CaCl2 0,6 M đạt nồng độ 30 mM.

* Tinh sạch thrombin

- Sắc ký trao đổi ion DEAE

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổi anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá, khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái lƣ̣c ma ̣nh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

Cột DEAE được rửa với nước, sau đó được cân bằng với đệm Tris- HCl 0,05M pH 8 và NaCl 0,05 M bằng 3 lần thể tích cột. Mẫu được nạp lên cột tinh sạch và thôi bằng đệm Tris -HCl 0,05M pH 8 và NaCl 1M. - Sắc ký ái lực Ni2+-NTA

Các phân đoạn được thu sau khi qua cột DEAE tiếp tục được đưa lên cột Ni-NTA sử dụng đệm gắn cột (Tris-HCl 0,01M pH8; NaCl 0,5M; imidazole 10mM). Sau đó cột được rửa với đệm rửa (Tris-HCl 0,01M pH8; NaCl 0,5M; imidazole 35mM) và được thôi bằng dung dịch đệm chứa muối 250 mM imidazole.

* Điện di SDS-PAGE

nồng độ 12,5% theo phƣơng pháp điện di biến tính (Laemmli, 1970). * Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; với mẫu đối chứng (-) không sử dụng thrombin và mẫu đối chứng (+) là thrombin được tách trong NaCl 0,05M. Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

2.2.2.5. Tách chiết thrombin với các ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác nhau nhau

*Tách thrombin ở thời gian ngâm mẫu khác nhau

Mẫu phổi thu thập được được rửa sạch với nước cất rồi sau đó rửa lại với nước muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi được giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn. Mẫu được ngâm ở thời gian 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong điều kiện 4C. Mẫu được ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu dịch. Dịch được tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để - 20C trong 15 phút. Mẫu sau đó được ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu dịch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% ở điều kiện 4C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa.

Tủa được hòa tan trong NaCl 0,05M. Lặp lại thí nghiệm tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20%, sau đó tủa được hòa tan trong NaCl 0,05M.

* Tinh sạch thrombin

- Sắc ký trao đổi ion DEAE

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổ i anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái lƣ̣c ma ̣nh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để điện di protein polyacrylamide với nồng độ 12,5% theo phƣơng pháp điện di biến tính.

Bản gel đƣợc đổ hai lớp, lớp dƣới là lớp gel tách đƣợc đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel co ở trên rồi cài lƣợc, để 30 phút cho gel đông hoàn toàn và ổn định. Thành phần gel đƣợc mô tả trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách

Thành phần Gel tách (l) Gel cô (l)

H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015

Bản điện di đƣợc lắp vào hệ thống điện di và chạy với cƣờng độ dòng điện 20 mA cho lớp gel cô và 30 mA cho lớp gel tách trong khoảng 2 giờ. Sau điện di bản gel đƣợc tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ và bản gel đƣợc tẩy bằng dung dịch tẩy. Các protein dƣới dạng monomer tinh sạch xuất hiện một băng duy nhất.

* Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ

sung 50 l thrombin; với mẫu đối chứng k hông sử dụng thrombin. Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

* Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo Bradford

2.2.2.6. Tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò

- Tách chiết thrombin ở điều kiện tối ƣu: Tách chiết thrombin với các nồng độ dung môi (aceton, ethanol), yếu tố vật lý (nhiệt độ, thời gian ngâm tách mẫu), pH tối ƣu.

- Tinh sạch thrombin:Mẫu protein sau khi đƣợc tách chiết sơ đƣợc tiếp tục qua các cột sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel.

- Điện di kiểm tra độ tinh sạch:Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để điện di protein polyacrylamide với nồng độ 12,5% theo phƣơng pháp điện di biến tính. - Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

2.2.3. Nghiên cứu bổ sung các chất an định (bền) cấu trúc của thrombin và tannic acid ở điều kiện môi trƣờng thƣờng tannic acid ở điều kiện môi trƣờng thƣờng

2.2.9.1. Đá nh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

2.2.9.2. Ảnh hưởng của các chất an định a. Đối với mẫu thrombin tinh sạch a. Đối với mẫu thrombin tinh sạch

Dịch thrombin tinh sạch đƣợc ủ với 0,05%; 0,1%; 0,5%; 1%; 2% và 5% (v/v) các chất hoạt động bề mặt nhƣ Tween 20; Tween 80; Triton X-100; PEG 4000 và SDS ở nhiệt độ 30C, sau 8 giờ và 24 giờ, hoạt tính thrombin còn lại (xác định qua thời gian chuyển hóa fibrinogen) đƣợc xác định để đánh giá ảnh hƣởng của chất an định lên protein thrombin tinh sạch

Dịch thrombin tinh sạch có bổ sung acid tannic 0,05% đƣợc ủ với 0,05%; 0,1%; 0,5%; 1%; 2% và 5% (v/v) các chất hoạt động bề mặt nhƣ Tween 20; Tween 80; Triton X-100; PEG 4000 và SDS ở nhiệt độ 30C, sau 8 giờ và 24 giờ, hoạt tính chuyển hóa fibrinogen còn lại (xác định qua thời gian chuyển hóa fibrinogen) đƣợc xác định để đánh giá ảnh hƣởng của chất an định lên sản phẩm.

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát hoạt tính của thrombin ở một số mẫu phổi bò đƣợc thu thập ở các vùng khác nhau.

Prothrombin đƣợc tách chiết tƣ̀ các mẫu phổi bò có kích thƣớc khoảng 72 kDa (Hình 3.1). Kết quả điê ̣n di đồ cho thấy rằng protein tách chiết tƣ̀ các mẫu