Tách chiết thrombin với các ngưỡng thời gian ngâm- 123docz.net

CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.5. Tách chiết thrombin với các ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác

nhau

*Tách thrombin ở thời gian ngâm mẫu khác nhau

Mẫu phổi thu thập được được rửa sạch với nước cất rồi sau đó rửa lại với nước muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi được giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn. Mẫu được ngâm ở thời gian 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong điều kiện 4C. Mẫu được ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu dịch. Dịch được tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để - 20C trong 15 phút. Mẫu sau đó được ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu dịch, tiếp tục bổ sung ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20% ở điều kiện 4C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa.

Tủa được hòa tan trong NaCl 0,05M. Lặp lại thí nghiệm tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 20%, sau đó tủa được hòa tan trong NaCl 0,05M.

* Tinh sạch thrombin

- Sắc ký trao đổi ion DEAE

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ƣ́ng trao đổ i anion giƣ̃a protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy khỏi cô ̣t bằng dung di ̣ch muối có chƣ́a ion có ái lƣ̣c ma ̣nh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

Cột DEAE được rửa với nước, sau đó được cân bằng với đệm Tris- HCl 0,05M pH 8 và NaCl 0,05 M bằng 3 lần thể tích cột. Mẫu được nạp lên cột tinh sạch và thôi bằng đệm Tris -HCl 0,05M pH 8 và NaCl 1M. Sắc ký ái lực Ni2+-NTA

Các phân đoạn được thu sau khi qua cột DEAE tiếp tục được đưa lên cột Ni-NTA sử dụng đệm gắn cột (Tris-HCl 0,01M pH8; NaCl 0,5M; imidazole 10mM). Sau đó cột được rửa với đệm rửa (Tris-HCl 0,01M pH8; NaCl 0,5M; imidazole 35mM) và được thôi bằng dung dịch đệm chứa muối 250 mM imidazole.

Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để điện di protein polyacrylamide với nồng độ 12,5% theo phƣơng pháp điện di biến tính.

Bản gel đƣợc đổ hai lớp, lớp dƣới là lớp gel tách đƣợc đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel co ở trên rồi cài lƣợc, để 30 phút cho gel đông hoàn toàn và ổn định. Thành phần gel đƣợc mô tả trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách

Thành phần Gel tách (l) Gel cô (l)

H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015

Bản điện di đƣợc lắp vào hệ thống điện di và chạy với cƣờng độ dòng điện 20 mA cho lớp gel cô và 30 mA cho lớp gel tách trong khoảng 2 giờ. Sau điện di bản gel đƣợc tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ và bản gel đƣợc tẩy bằng dung dịch tẩy. Các protein dƣới dạng monomer tinh sạch xuất hiện một băng duy nhất.

* Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ

sung 50 l thrombin; với mẫu đối chứng k hông sử dụng thrombin. Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

* Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo Bradford

Tách chiết thrombin với các ngưỡng thời gian ngâm tách mẫu khác

Tách chiết thrombin ở độ pH khác nhau

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN