Tách thrombin ở nồng độ aceton khác nhau

CHƢƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.2. Tách thrombin ở nồng độ aceton khác nhau

*Tách thrombin ở nồng độ acetone khác nhau

Mẫu phổi thu thâ ̣p đƣợc đƣợc rƣ̉a sa ̣ch với nƣớc cất rồi sau đó rƣ̉a la ̣i với nƣớc muối NaCl 0,05M; bảo quản mẫu ở -20C.

Mẫu phổi đƣợc giã đông , 10 g mẫu bổ sung với 10 ml NaCl 0,05M, xay nhuyễn, ngâm mẫu 24 giờ trong điều kiê ̣n 4C. Mẫu đƣợc ly tâm 4000 rpm, 20 phút, thu di ̣ch. Dịch đƣợc tủa với ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ cuối cùng là 10%, để -20C trong 15 phút. Mẫu sau đó đƣợc ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, thu di ̣ch, tiếp tu ̣c bổ sung acetone tuyê ̣t đối để đa ̣t nồng đô ̣ cuối cùng là 20%, 30%, 40%, 50%, 60% để -20C trong 10 phút, ly tâm 4000 rpm trong 20 phút, thu tủa. Tủa đƣợc hòa tan trong NaCl 0,05 M. Lă ̣p la ̣i thí nghiê ̣m tủa với acetone tuyê ̣t đối để đ ạt nồng độ acetone cuối cùng nhƣ trên . Dịch thu đƣợc bổ sung CaCl2 0,6 M đạt nồng đô ̣ 30 mM.

*Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin

Dịch thrombin sau khi tách từ mẫu đƣợc khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ƣ́ng 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l thrombin; vớ i mẫu đối chƣ́ng không sƣ̉ du ̣ng thrombin . Quan sát thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

*Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Dƣ̣a trên cơ sở của phản ứng trao đổi anion giữa protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl tích điê ̣n dƣơng ) của chất giá , khi hỗn hợp protein qua cô ̣t , các protein tích điện âm gắn vào cột và sau đó đƣợc

đẩy khỏi cô ̣t bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.

*Sắc ký lọc gel Biogel P100

Là cột phân tách hỗn hợp protein theo nguyên tắc lọc gel . Biogel P100 là mô ̣t polyacrylamide trong đó phân tƣ̉ của chúng l iên kết với nhau bởi các liên kết ngang ta ̣o thành sàng phân tƣ̉ bởi hê ̣ thống lỗ lƣới xốp . Dƣ̣a vào sƣ̣ khác nhau về kích thƣớc và phân tƣ̉ lƣợng của các protein có trong hỗn hợp để phân tách.

Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml.

* Điện di SDS-PAGE

Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch protein đƣợc đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide.

* Xác định hàm lƣợng protein

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo Bradford.