Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đặc điểm của giống đậu tương ĐT12
Giống đậu tương được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu là ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ cung cấp. Giống đậu tương ĐT12 nhập nội từ Trung Quốc năm 1996, được trung tâm NCTN Đậu đỗ chọn lọc phát triển và hội đồng khoa học Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam cho phép khu vực hoá tháng 5 năm 2001 và được công nhân là giống Tiên bộ kỹ thuật năm 2002 theo quyết định sô 5310QĐ /BNN-KHCN ngày 29/11/2002. ĐT12 Có thời gian sinh trưởng cực ngắn từ 71 đến 75 ngày, thuộc loại hình sinh trưởng hữu hạn, cứng cây, hoa trắng, lông phủ màu trắng, quả chín có màu xám. Hạt đậu tương ĐT12 có dạng hình cầu, màu vàng nhạt, rốn hạt có màu nâu, kích thước rốn là 3,5 mm (Hình 2.1).
Hình 2.1. Hạt của giống đậu tương ĐT12
Giống đậu tương ĐT12 có chiều cao cây từ 35-50cm, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình (18- 30), tỷ lệ quả 3 hạt cao (19- 40%) khối
lượng 100 hạt (15.0-17.7g). ĐT12 có khả năng chống đổ và tách quả tốt. Nhiễm bệnh mức nhẹ đến trung bình đối với một số bệnh hại chính. ĐT-12 có ưu điểm khi quả chín bộ lá héo và rụng nhanh. Năng suất từ 14 đến 23 tạ/ha, tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. Giống ĐT12 được trồng phổ biến ở miền Bắc. Vụ xuân gieo từ 20 tháng 2 đến 20 tháng 3, vụ hè từ 15 tháng 5 đến 15 tháng 6, vụ đông từ 20 tháng 9 đến 5 tháng 10. Mật độ gieo ở vụ xuân là 40-45 cây/m2, ở vụ hè là 35-40 cây/m2, còn ở vụ đông 55-60 cây/m2.
2.1.2. Chủng A. tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pBI121-GmDREB2
Chủng A. tumefaciens chứa cấu trúc pBI121-GmDREB2 mang gen
GmDREB2 do Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp. Cấu trúc vector chuyển gen được trình bày ở hình 2.2.
GmDREB2
pBI121-GmDREB2
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen GmDREB2
(pBI121-GmDREB2). (LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải của T-DNA; KanR: trình tự kháng kanamycin; 35S: promoter 35S; GmDREB2: trình tự gen GmDREB2; cmyc: trình tự nucleotide mã hóa kháng nguyên cmyc; NOS (Nos ter): nopaline synthase terminator (đoạn kết thúc)
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
Các loại hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm được cung cấp bởi các Hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech, như: Yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, KCl, tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol. Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose,...) …
Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như: box cấy vô trùng, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy quang phổ,...Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser cùng với các trang thiết bị khác.
Môi trường tái sinh in vitro từ nách lá mầm đậu tương theo Olhoft và đtg (2001) [17]; Nguyễn Thị Thúy Hường (2009) (2011) [4] (Bảng 2.1).
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm chuyển gen ở đậu tương thông qua A. tumefaciens được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên từ tháng 6/2016 đến tháng 12/2016. Phân tích cây đậu tương chuyển gen thông qua xác định sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR tại Phòng ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro ở đậu tương
Môi trường Ký hiệu Thành phần
Nảy mầm hạt (Germination medium)
GM MS cơ bản + Muối B5 3,052g/l + sucrose 20g/l + agar 9g/l + vitamin B5 1mg/l
Đồng nuôi cấy (Co- cultivation medium)
CCM MS cơ bản + Muối B5 0,316g/l + MES 3,9g/l + sucrose 30g/l + agar 5g/l + vitamin B5 1mg/l + AS 0,2mM + L- cysteine 400mg/l + Sodium thiosulfate 158mg/l + DTT 154mg/l + GA3
0,25mg/l + BAP 1,5mg/l; pH = 5,4 Cảm ứng tạo đa chồi
(Shoot induction medium)
SIM MS cơ bản + Muối B5 3,052g/l + MES 0,59g/l + sucrose 30g/l + vitamin B5 1mg/l + BAP 1,5mg/l
Kéo dài chồi (Shoot elongation medium)
SEM MS cơ bản + MES 0,59g/l + sucrose 30g/l + agar 9g/l + vitamin B5 1mg/l + L-asparagine 50mg/l + L-pyron glutamic acid 100mg/l + IAA 0,1mg/l + GA3 0,5mg/l
Ra rễ (Rooting medium)
RM MS cơ bản + MES 0,59g/l + sucrose 20g/l + agar 9g/l + IBA 0,1mg/l + vitamin B5 1mg/l