Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào đậu tương
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm nhờ A.tumefaciens
được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và đtg (2006) và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu tương của Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) [4]. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen được mô tả tổng quát trong hình 2.3.
Hạt đậu tương
Khử trùng bề mặt (khí Clo, 16 giờ) Nảy mầm trên GM
Nuôi lỏng tạo huyền phù Ly tâm thu cặn khuẩn, hoà cặn trong CCM (OD6000,6-1)
Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn Lây nhiễm 30 – 40 phút
Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l)
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l )
Ra rễ trên RM (bổ sung IBA0,1 mg/l)
5 ngày
2 tuần
Ra cây
(giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin75 mg/l )
2 tuần
2 tuần/lần
14-20 ngày
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào đậu tương qua nách lá mầm
Tạo nguyên liệu biến nạp gen: Hạt đậu tương khử trùng bằng khí clo tạo ra từ hỗn hợp javen 100ml + HCl 3ml đậm đặc rồi cho nảy mầm trên môi trường MS. Sau 4 - 5 ngày, lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Nuôi chọn lọc vi khuẩn trong 15ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc là kanamycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l ở 28oC, 150 rpm, 48 giờ. Chuyển 10ml dịch huyền phù tế bào trên vào 50ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28oC, 150 rpm đến khi OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế bào ở 4oC, 5000 rpm, 15 phút. Hoà tan tế bào lắng tạo huyền phù vi khuẩn vào 40ml dung dịch môi trường CCM đặt trong nước đá lạnh.
Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Các mảnh lá mầm đậu tương được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7 - 8 lần vào phần nách lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian 5 ngày.
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung 500 cefotaxim mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo chồi SIM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l (lần 1). Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 75 mg/l (lần 2).
Kéo dài chồi: Sau 2 - 3 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
Tạo rễ: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 4 cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh.
Cây ra giá thể: Những cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh được đưa ra bầu trấu hun: cát (tỷ lệ 1 : 1). Sau khoảng 1 - 2 tuần, các cây sống sót được trồng ra nhà lưới. Tính toán thời gian biến nạp và tái sinh để thời điểm ra cây trùng với thời vụ gieo trồng đậu tương.
Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux.