4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đặc điểm của giống đậu tương ĐT12
Giống đậu tương được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu là ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ cung cấp. Giống đậu tương ĐT12 nhập nội từ Trung Quốc năm 1996, được trung tâm NCTN Đậu đỗ chọn lọc phát triển và hội đồng khoa học Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam cho phép khu vực hoá tháng 5 năm 2001 và được công nhân là giống Tiên bộ kỹ thuật năm 2002 theo quyết định sô 5310QĐ /BNN-KHCN ngày 29/11/2002. ĐT12 Có thời gian sinh trưởng cực ngắn từ 71 đến 75 ngày, thuộc loại hình sinh trưởng hữu hạn, cứng cây, hoa trắng, lông phủ màu trắng, quả chín có màu xám. Hạt đậu tương ĐT12 có dạng hình cầu, màu vàng nhạt, rốn hạt có màu nâu, kích thước rốn là 3,5 mm (Hình 2.1).
Hình 2.1. Hạt của giống đậu tương ĐT12
Giống đậu tương ĐT12 có chiều cao cây từ 35-50cm, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình (18- 30), tỷ lệ quả 3 hạt cao (19- 40%) khối
lượng 100 hạt (15.0-17.7g). ĐT12 có khả năng chống đổ và tách quả tốt. Nhiễm bệnh mức nhẹ đến trung bình đối với một số bệnh hại chính. ĐT-12 có ưu điểm khi quả chín bộ lá héo và rụng nhanh. Năng suất từ 14 đến 23 tạ/ha, tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. Giống ĐT12 được trồng phổ biến ở miền Bắc. Vụ xuân gieo từ 20 tháng 2 đến 20 tháng 3, vụ hè từ 15 tháng 5 đến 15 tháng 6, vụ đông từ 20 tháng 9 đến 5 tháng 10. Mật độ gieo ở vụ xuân là 40-45 cây/m2, ở vụ hè là 35-40 cây/m2, còn ở vụ đông 55-60 cây/m2.
2.1.2. Chủng A. tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pBI121-GmDREB2
Chủng A. tumefaciens chứa cấu trúc pBI121-GmDREB2 mang gen
GmDREB2 do Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp. Cấu trúc vector chuyển gen được trình bày ở hình 2.2.
GmDREB2
pBI121-GmDREB2
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen GmDREB2
(pBI121-GmDREB2). (LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải của T-DNA; KanR: trình tự kháng kanamycin; 35S: promoter 35S; GmDREB2: trình tự gen GmDREB2; cmyc: trình tự nucleotide mã hóa kháng nguyên cmyc; NOS (Nos ter): nopaline synthase terminator (đoạn kết thúc)
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
Các loại hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm được cung cấp bởi các Hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech, như: Yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, KCl, tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol. Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose,...) …
Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như: box cấy vô trùng, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy quang phổ,...Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser cùng với các trang thiết bị khác.
Môi trường tái sinh in vitro từ nách lá mầm đậu tương theo Olhoft và đtg (2001) [17]; Nguyễn Thị Thúy Hường (2009) (2011) [4] (Bảng 2.1).
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm chuyển gen ở đậu tương thông qua A. tumefaciens được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên từ tháng 6/2016 đến tháng 12/2016. Phân tích cây đậu tương chuyển gen thông qua xác định sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR tại Phòng ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro ở đậu tương
Môi trường Ký hiệu Thành phần
Nảy mầm hạt (Germination medium)
GM MS cơ bản + Muối B5 3,052g/l + sucrose 20g/l + agar 9g/l + vitamin B5 1mg/l
Đồng nuôi cấy (Co- cultivation medium)
CCM MS cơ bản + Muối B5 0,316g/l + MES 3,9g/l + sucrose 30g/l + agar 5g/l + vitamin B5 1mg/l + AS 0,2mM + L- cysteine 400mg/l + Sodium thiosulfate 158mg/l + DTT 154mg/l + GA3
0,25mg/l + BAP 1,5mg/l; pH = 5,4 Cảm ứng tạo đa chồi
(Shoot induction medium)
SIM MS cơ bản + Muối B5 3,052g/l + MES 0,59g/l + sucrose 30g/l + vitamin B5 1mg/l + BAP 1,5mg/l
Kéo dài chồi (Shoot elongation medium)
SEM MS cơ bản + MES 0,59g/l + sucrose 30g/l + agar 9g/l + vitamin B5 1mg/l + L-asparagine 50mg/l + L-pyron glutamic acid 100mg/l + IAA 0,1mg/l + GA3 0,5mg/l
Ra rễ (Rooting medium)
RM MS cơ bản + MES 0,59g/l + sucrose 20g/l + agar 9g/l + IBA 0,1mg/l + vitamin B5 1mg/l
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào đậu tương
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm nhờ A.tumefaciens
được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và đtg (2006) và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu tương của Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) [4]. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen được mô tả tổng quát trong hình 2.3.
Hạt đậu tương
Khử trùng bề mặt (khí Clo, 16 giờ) Nảy mầm trên GM
Nuôi lỏng tạo huyền phù Ly tâm thu cặn khuẩn, hoà cặn trong CCM (OD6000,6-1)
Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn Lây nhiễm 30 – 40 phút
Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l)
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l )
Ra rễ trên RM (bổ sung IBA0,1 mg/l)
5 ngày
2 tuần
Ra cây
(giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin75 mg/l )
2 tuần
2 tuần/lần
14-20 ngày
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào đậu tương qua nách lá mầm
Tạo nguyên liệu biến nạp gen: Hạt đậu tương khử trùng bằng khí clo tạo ra từ hỗn hợp javen 100ml + HCl 3ml đậm đặc rồi cho nảy mầm trên môi trường MS. Sau 4 - 5 ngày, lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Nuôi chọn lọc vi khuẩn trong 15ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc là kanamycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l ở 28oC, 150 rpm, 48 giờ. Chuyển 10ml dịch huyền phù tế bào trên vào 50ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28oC, 150 rpm đến khi OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế bào ở 4oC, 5000 rpm, 15 phút. Hoà tan tế bào lắng tạo huyền phù vi khuẩn vào 40ml dung dịch môi trường CCM đặt trong nước đá lạnh.
Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Các mảnh lá mầm đậu tương được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7 - 8 lần vào phần nách lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian 5 ngày.
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung 500 cefotaxim mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo chồi SIM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l (lần 1). Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 75 mg/l (lần 2).
Kéo dài chồi: Sau 2 - 3 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
Tạo rễ: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 4 cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh.
Cây ra giá thể: Những cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh được đưa ra bầu trấu hun: cát (tỷ lệ 1 : 1). Sau khoảng 1 - 2 tuần, các cây sống sót được trồng ra nhà lưới. Tính toán thời gian biến nạp và tái sinh để thời điểm ra cây trùng với thời vụ gieo trồng đậu tương.
Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux.
2.2.2. Phân tích cây chuyển gen
DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của Saghai Maroof và đtg (1984) [20].
Thành phần đệm tách DNA tổng số được thể hiện ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 4 CTAB 2% (w/v)
5 Nước khử ion vô trùng
DNA tổng số được tách chiết từ lá đậu tương theo các bước sau: 1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ.
2) Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong 90 phút.
3) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
4) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.
5) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70oC.
6) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20oC.
Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI để khuếch đại gen GmDREB2 từ DNA hệ gen của các cây đậu tương chuyển gen ở T0. Xác định sự có mặt của vector pBI121-GmDREB2 trong cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 35S-F/35S-R để khuếch đại đoạn 35S trong vector pBI121- GmDREB2 từ DNA hệ gen của các cây đậu tương chuyển gen ở T0. Trình tự nucleotide của că ̣p mồi GmDREB2-
BamHI/Cmyc-SacI và 35S-F/35S-R trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các că ̣p mồi PCR
Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’ - 3’) Sả n phẩm
dự kiến
GmDREB2-BamHI/
GmDREB2-Cmyc-SacI
CGGATCCGATGGAAGAAGCGGGTTTAGG 543 bp CGAGCTCGTCAATTCAGATCCTCTTCTG 35S-F/35S-R CACGACACACTTGTCTAC 314 bp TCACATCAATCCACTTGCT
Thành phần của phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.4 .
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nước khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2.5µl 3 MgCl2 (25mM) 2µl 4 dNTPs (10mM) 2.5µl
5 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 1µl
6 Mồi ngược (10 pmol/µl) 1µl
7 Taq DNA polymerase ( 5 đơn vị/ µl) 1µl
8 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2µl
Tổng 25µl
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.5
Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút Lặp lại 30 chu kỳ 3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:
Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá mầm được tái sinh chồi từ nách lá mầm và hai lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây trồng trên giá thể của mỗi mẫu biến nạp dương tính với PCR tạo thành một dòng cây đậu tương chuyển gen.
Chương 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀ TÁI SINH CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN TƯƠNG CHUYỂN GEN
Giống đậu tương ĐT12 được chọn làm đối tương nhận gen chuyển
GmDREB2. Trong thí nghiệm này, cấu trúc mang gen chuyển GmDREB2
(pBI121- GmDREB2) được chuyển vào cây đậu tương qua nách lá mầm bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens.
3.1.1. Kết quả khử trùng hạt và tạo nguyên liệu biến nạp
Hạt đậu tương ĐT12 chín được chọn lọc, khử trùng và cấy trên môi trường nảy mầm GM (Hình 3.1). Loại bỏ các hạt kém chất lượng và thực hiện khử trùng trong bình thủy tinh chứa khí clo được đậy bằng nắp kín và được đặt trong tủ hút.
A B C
Hình 3.1. Giai đoạn chuẩn bị mẫu biến nạp.
A: Lựa chọn hạt; B: Khử trùng hạt bằng khí clo; C: Hạt sau khi khử trùng được cấy trên môi trường nảy mầm GM
Hạt sau khi khử trùng được cấy trên môi trường nảy mầm GM trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux.
3.1.2. Lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
Hạt đậu tương nảy mầm trên môi trường GM, sau khoảng 5 ngày, kích thước mầm đạt khoảng 5 cm và lá mầm xanh (Hình 3.2A). Các mảnh lá mầm được thu, gây tổn thương ở nách lá mầm để sử dụng làm mẫu biến nạp (Hình 3.2B).
A B
C D
Nách lá mầm
Hình 3.2. Giai đoạn gây tổn thương nách lá mầm và biến nạp.
A: hạt đậu tương ĐT12 nảy mầm trên môi trường GM; B: gây tổn thương nách lá mầm; C: mảnh lá mầm được nhiễm khuẩn; D: mẫu biến nạp chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc.
Toàn bộ các thao tác thí nghiệm và quá trình biến nạp được thao tác trong box khử trùng. Tiến hành cắt lấy lá mầm, tách hai lá mầm, loại bỏ chồi chính, dùng mũi dao nhọn gây tổn thương vào nách lá mầm khoảng 5 đến 7 lần. Lá mầm đã gây tổn thương được ngâm trong ngâm trong dịch huyền phù chứa A.tumefaciens mang cấu trúc chứa gen GmDREB2 có OD600 đạt 0,8 trong thời gian 30 phút (Hình 3.2C). Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc (Hình 3.2D). Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trường (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong thời gian là 10 phút để rửa khuẩn ngoại vi, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt lấy các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh thích hợp.
Sau 2 tuần, những cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) có bổ sung thêm 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh kanamicin. Hình 3.3 trình bày kết quả cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong thời gian 2 tuần bổ sung BAP 2mg/l và kanamycine, sau đó chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM trong 2 tuần, bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l.
A B
C D
Hình 3.3. Giai đoạn tạo đa chồi và kéo dài chồi.
A: Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM trong 1 tuần bổ sung BAP 2mg/l và kanamycine; B: Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM trong 2 tuần bổ sung BAP 2mg/l và kanamycine; C: Kéo dài chồi SEM trong 1 tuần (bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l); D: Kéo dài chồi SEM trong 2 tuần (bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l)
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh (Hình 3.4).
A B CC
Hình 3.4. Giai đoạn ra rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen ĐT12 trên giá thể.