Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong cây đậu tương
CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN Ở THẾ HỆ T0
Kết quả tách chiết DNA từ hệ gen cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen
Các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 sống sót trên giá thể được tiến hành kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen chuyển pBI121-
GmDREB2. Thu lá non của cây đậu tương không chuyển gen và 5 cây đậu tương chuyển gen để tách chiết DNA tổng số trong đệm CTAB, điện di sản phẩm tách chiết DNA, nhuộm và chụp ảnh dưới ánh đèn tia cực tím. Kết quả điện di DNA tổng số ở hình 3.5 cho thấy DNA tổng số thu được từ cây không chuyển gen và 5 cây chuyển gen đảm bảo chất lượng cho phản ứng PCR.
1 2 3 4 5 6
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA ở thế hệ T0.
1: Hình ảnh DNA tổng số tách từ cây không chuyển gen; 2, 3, 4, 5, 6: DNA tổng số tách từ các cây đậu tương chuyển gen T0.
Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời thao tác đơn giản, chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một lượng DNA theo mong muốn, phương pháp PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu
phân tích hệ gen sinh vật, trong đó có PCR được sử dụng để xác định kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển ở các cây được chuyển gen. PCR là phương pháp nhanh, chính xác để đánh giá cây chuyển gen. Chính vì những lý do trên mà trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 35S-F/35S-R để kiểm tra sự có mặt của vecter mang cấu trúc pBI121-
GmDREB2 trong cây đậu tương chuyển gen. Vector tor chuyển gen pBI121 chứa promoter 35S và cặp mồi 35S-F/35S-R nhân bản đoạn 35S dự tính có kích thước 314 bp. Hình 3.6 trình bày kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn promoter 35S trong cấu trúc pBI121.
0,25 kb
0,5 kb
0,3 kb
( M (+) (-) 1 2 3 4 5
Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của đoạn
promoter 35S của cấu trúc mang gen chuyển GmDREB2 trong các cây đậu tương chuyển gen.
M: thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR các cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05; (+): sản phẩm PCR từ vector pBI121; (-): kết quả PCR từ hệ gen cây không chuyển gen.
Hình 3.6 cho thấy băng DNA có kích thước khoảng 0,3 kb xuất hiện ở đối chứng dương (+), vector pBI121-GmDREB2 và ở các cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05, trong khi đối chứng âm (-) không có
băng DNA ở kích thước này. Như vậy, cấu trúc pBI121-GmDREB2 đã có mặt ở 4 cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 ở thế hệ T0.
Tiếp theo là thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi GmDREB2-
BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI để xác định sự có mặt của gen chuyển
GmDREB2 trong 5 cây đậu tương được chuyển gen ở T0 thu được sau khi tiến hành thí nghiệm chuyển gen. Hình 3.6 trình bày kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB2 từ DNA của cây không chuyển gen và các cây chuyển gen ở thế hệ T0.
(+) M (-) 1 2 3 4 5
~0,55 kb
0,5 kb
0,75 kb
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen
chuyển GmDREB2 bằng cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-cmyc-SacI từ hệ gen các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0.
M: thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR nhân bản gen GmDREB2 từ hệ gen các cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12- 05; (+): sản phẩm PCR gen GmDREB2 từ vector pBI121-GmDREB2; (-) kết quả PCR từ hệ gen cây không chuyển gen.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR nhân gen
GmDREB2 ở hình 3.6 cho thấy đối chứng dương (vector pBI121-GmDREB2) và các cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 tồn tại băng DNA có kích thước khoảng 0,55 kb. Theo tính toán lý thuyết, cặp mồi
GmDREB2-BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI nhân đoạn DNA gồm gen
GmDREB2 và trình tự nucleotide cho hoạt động cắt của hai enzyme BamHI và SacI là 498 bp; đoạn Cmyc và KDEL có kích thước là 33+12 = 45 bp và dự tính sản phẩm của PCR với cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-Cmyc- SacI sẽ nhân bản được đoạn DNA có kích thước là 498 + 45 = 543 bp. Như vậy, kết quả PCR thu được đoạn DNA có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (543 bp) là cơ sở để nhận xét rằng gen chuyển GmDREB2 đã được chuyển thành công vào giống đậu tương ĐT12.
Gen GmDREB2 của cây đậu tương có kích thước 480 bp và không có intron; gen GmDREB2 phân lập từ mRNA (cDNA) của cây đậu tương có kích thước 480 được sử dụng làm gen chuyển. Gen GmDREB2 nội sinh và gen chuyển GmDRER2 có cùng kích thước 480 bp, cho nên không thể kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng cách nhân bản đoạn gen GmDREB2 (480 bp) bằng PCR. Chính vì vậy, cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI cho PCR đã được sử dụng để nhân bản đoạn DNA gồm gen GmDREB2, Cmyc, KDEL và trình tự cắt của BamHI và SacI (543 bp).
Cả hai thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR nhân bản đoạn promoter 35S và gen GmDREB2 đều cho kết quả ở 4 cây đậu tương chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 ở thế hệ T0. Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn kiểm tra gen chuyển bằng PCR là 4/300 = 1,33%.