Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.1. Kết quả chuyển gen GmDREB2 và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
3.1.2. Lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
Hạt đậu tương nảy mầm trên môi trường GM, sau khoảng 5 ngày, kích thước mầm đạt khoảng 5 cm và lá mầm xanh (Hình 3.2A). Các mảnh lá mầm được thu, gây tổn thương ở nách lá mầm để sử dụng làm mẫu biến nạp (Hình 3.2B).
A B
C D
Nách lá mầm
Hình 3.2. Giai đoạn gây tổn thương nách lá mầm và biến nạp.
A: hạt đậu tương ĐT12 nảy mầm trên môi trường GM; B: gây tổn thương nách lá mầm; C: mảnh lá mầm được nhiễm khuẩn; D: mẫu biến nạp chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc.
Toàn bộ các thao tác thí nghiệm và quá trình biến nạp được thao tác trong box khử trùng. Tiến hành cắt lấy lá mầm, tách hai lá mầm, loại bỏ chồi chính, dùng mũi dao nhọn gây tổn thương vào nách lá mầm khoảng 5 đến 7 lần. Lá mầm đã gây tổn thương được ngâm trong ngâm trong dịch huyền phù chứa A.tumefaciens mang cấu trúc chứa gen GmDREB2 có OD600 đạt 0,8 trong thời gian 30 phút (Hình 3.2C). Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc (Hình 3.2D). Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trường (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong thời gian là 10 phút để rửa khuẩn ngoại vi, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt lấy các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh thích hợp.
Sau 2 tuần, những cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) có bổ sung thêm 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh kanamicin. Hình 3.3 trình bày kết quả cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong thời gian 2 tuần bổ sung BAP 2mg/l và kanamycine, sau đó chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM trong 2 tuần, bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l.
A B
C D
Hình 3.3. Giai đoạn tạo đa chồi và kéo dài chồi.
A: Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM trong 1 tuần bổ sung BAP 2mg/l và kanamycine; B: Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM trong 2 tuần bổ sung BAP 2mg/l và kanamycine; C: Kéo dài chồi SEM trong 1 tuần (bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l); D: Kéo dài chồi SEM trong 2 tuần (bổ sung thêm GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l + kanamycine 50 mg/l)
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh (Hình 3.4).
A B CC
Hình 3.4. Giai đoạn ra rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen ĐT12 trên giá thể.
A, B: Ra rễ trong môi trường RM bổ sung thêm 250 mg/l cefotaxim trong 20 ngày; C : Ra cây và trồng trên giá thể
Thí nghiệm biến nạp cấu trúc chứa gen GmDREB2 qua nách lá mầm nhờ A.tumefaciens được thực hiện lặp lại 3 lần cùng với 2 lô đối chứng (ĐC0 và ĐC1). ĐC0 là lô mà mảnh lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; còn ĐC1 là lô mà mảnh lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh. Kết quả thí nghiệm chuyển gen và đối chứng được trình bày ở bảng 3.1. Kết quả thống kê ở bảng 3.1 cho thấy, trong 300 mẫu được biến nạp cấu trúc chứa gen GmDREB2 thì có 203 mẫu tạo được đa chồi, trong đó có 393 chồi sống sót. Lựa chọn được 197 chồi để kéo dài và số chồi được cho ra rễ là 60, số cây được cho ra giá thể là 20 cây và có 5 cây sống sót. Đối với lô đối chứng ĐC0, với 30 mẫu biến nạp và kết quả không có chồi nào được tạo thành, vì thế cũng không có chồi được kéo dài, ra rễ và ra giá thể. Đối với lô đối chứng ĐC1, với 30 mẫu biến nạp thì có 20 mẫu được tạo đa
chồi, có 35 chồi sống sót, có 20 chồi được kéo dài và 15 chồi được chuyển vào môi trường ra rễ, số cây được đưa ra giá thể là 15 cây, trong đó có 10 cây sống sót. Như vậy ở giai đoạn tái sinh in vitro, kết quả chọn lọc bằng kháng sinh thu được 5 cây đậu tương được chuyển gen T0. Các cây đậu tương chuyển gen T0 được ký hiệu là: ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05. Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn chọn lọc bằng kháng sinh chiếm tỷ lệ 1,67%.
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12
Ghi chú: ĐC0*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.
Lô đối chứng và thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số chồi sống sót Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây trồng trên giá thể Số cây sống sót ĐC0 30 0 0 0 0 0 0 ĐC1 30 20 35 20 15 15 10 1 100 68 136 67 20 7 1 2 100 55 109 45 15 5 2 3 100 80 148 85 25 8 2 Tổng TN (1, 2, 3) 300 203 393 197 60 20 5