2.2.6. Thử nghiệm chế phẩm trên cây bạch chỉ
2.2.6.1. Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ
Các thí nghiệm đồng ruộng tiến hành tại: Trung tâm NC trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội.
Sản phẩm lên men dịch thể
(cho từng chủng riêng rẽ)
Sản phẩm phối trộn của các chủng
Phối trộn với chất mang
(Vlên men: Wchất mang=1:2) Sấy 400C, độ ẩm 10% Trộn với than bùn (1:1) Đóng gói, bảo quản chế phẩm rắn (Mật độ: 108 VSV)
+ Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Công thức 1: Bón chế phẩm VH1
Công thức 2: Không bón chế phẩm VH1 (đối chứng)
Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB), ba lần nhắc lại. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 30m2. Diện tích thí nghiệm là 360m2 (bao gồm các luống trồng bảo vệ).
+ Các chỉ tiêu theo dõi tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ:
Chỉ tiêu sinh trưởng:
- Ngày gieo
- Thời gian từ gieo đến mọc (ngày) - Thời gian từ gieo đến trồng (ngày) - Chiều cao cây (cm)
- Số lá (lá/cây)
- Đường kính tán (cm)
Chỉ tiêu sinh trưởng rễ củ và năng suất rễ củ bạch chỉ:
- Chiều dài rễ củ (cm) - Đường kính rễ củ (cm) - Khối lượng rễ củ/cây (g) - Tỷ lệ rễ củ tươi/khô.
- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) - Năng suất thực thu (tấn/ha)
+ Phương pháp theo dõi:
- Thời gian từ gieo đến mọc (ngày): Tính từ ngày gieo đến ngày hạt mọc 50%.
- Thời gian từ gieo đến trồng (ngày): Tính từ ngày gieo đến ngày đánh trồng cây con.
- Thời gian sinh trưởng (ngày): Tính từ ngày gieo đến ngày thu hoạch dược liệu.
- Chiều cao cây (cm): Sử dụng thước có độ chính xác đến 10-1cm để đo. Chiều cao cây được xác định ở đây là chiều cao vuốt lá. Khi đo vuốt lá thẳng lên và đo.
- Số lá: Đếm số lá của cây tại các thời điểm khác nhau và khi thu hoạch. - Đường kính tán (cm): Dùng thước có độ chính xác đến 10-1cm. Tiến hành đo đường kính tán cây theo hướng: Đông - Tây và Nam - Bắc sau đó cộng lại và lấy giá trị trung bình, đó là đường kính tán của cây.
- Chiều dài rễ củ (cm): Dùng thước có độ chính xác đến 10-1cm, đo từ gốc đến chóp rễ củ (phía cuối của rễ củ dài nhất trong khóm).
- Đường kính rễ củ (cm): Dùng thước có độ chính xác đến 10-1cm để đo, đo tại phần đầu rễ củ.
- Khối lượng rễ củ/cây (g): Sau khi thu hoạch loại bỏ hết đất, cát bám vào rễ củ cây. Tiến hành cân khối lượng rễ củ/cây.
- Năng suất lý thuyết (tấn/ha):
NNSLT = Khối lượng rễ củ/cây (g) x Mật độ (cây/ha) - Năng suất thực thu (tấn/ha):
NNSTT = Năng suất thực thu/sào
x 10.000 360m2
- Tỷ lệ củ Tươi/khô:
C = Khối lượng rễ củ tươi Khối lượng rễ củ khô
2.2.6.2. Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến hàm lượng chất imperatorin của rễ củ cây bạch chỉ sau khi thu hoạch
Xác định hàm lượng hợp chất imperatorin trong mẫu rễ củ cây bạch chỉ của 2 công thức thí nghiệm bằng phương pháp HPLC-DAD.
+ Nguyên liệu: 2 mẫu rễ củ cây bạch chỉ khô:
BC1: rễ củ cây bạch chỉ không bón chế phẩm VH1 (đối chứng). BC2: rễ củ cây bạch chỉ bón chế phẩm VH1.
+ Hóa chất, thiết bị:
- CH3OH dùng cho HPLC (Merck). - CH3CN dùng cho HPLC (Merck). - Nước cất tinh khiết.
- Chất chuẩn: Imperatorin tinh khiết (Merck)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, detector DAD.
- Cân phân tích Ohaus-USA độ chính xác 0,0001g - Vial, bình định mức các loại.
- Micropipette có độ chính xác phù hợp.
+ Phương pháp phân tích:
Chiết mẫu thực vật:
Cân khoảng 2 gam mẫu rễ củ bạch chỉ khô, chiết siêu âm trong 50ml MeOH ở 50oC trong thời gian 24 giờ. Lặp lại quá trình chiết 3 lần và gộp các dịch chiết lại. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm các mẫu dịch chiết thu được các cao chiết MeOH tương ứng.
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân khoảng 100mg cao chiết MeOH mẫu rễ củ bạch chỉ, chuyển vào bình định mức 10ml, thêm MeOH tới vạch mức, lắc đều. Dung dịch thu được được lọc qua màng lọc 0.45µm trước khi phân tích bằng HPLC.
Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Các dung dịch chuẩn được pha từ imperatorin tinh khiết trong MeOH ở các nồng độ 20, 50, 100, 200, 500µg/ml và được bảo quản tránh ánh sáng ở 4oC cho đến khi phân tích.
+ Xây dựng phương pháp phân tích mẫu rễ củ bạch chỉ:
Phương pháp phân tích định lượng imperatorin trong mẫu cây bạch chỉ được xây dựng trên cơ sở khảo sát mẫu cây bạch chỉ và chất chuẩn imperatorin. Qua tham khảo các tài liệu [22,42] và tiến hành khảo sát các yếu tố: bước sóng cho độ hấp thụ cực đại, loại cột sắc ký, nhiệt độ cột, tỷ lệ thành phần pha động, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng imperatorin trong mẫu cây bạch chỉ được xây dựng như sau:
Điều kiện phân tích: ĐK-BC
- Cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250mm, 5µm) - Detector DAD, bước sóng phát hiện 254nm.
- Nhiệt độ cột 25oC - Tốc độ dòng 0.5ml/ph - Thể tích tiêm mẫu 10µl
- Pha động MeOH-H2O, chương trình gradient dung môi:
Thời gian (phút) 0 10 25 35 45 60 65 80
MeOH