cây bạch chỉ sau khi thu hoạch
+ Định lượng imperatorin trong cao chiết MeOH mẫu rễ củ bạch chỉ BC1.
Tiến hành định lượng mẫu phân tích BC1, BC2 với điều kiện sắc ký
ĐK-BC. Hàm lượng chất phân tích được xác định theo đường chuẩn. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.10: Kết quả xác đinh hàm lượng imperatorin trong cao chiết MeOH mẫu BC1
STT Nồng độ mẫu phân tích
(mg/ml) Diện tích pic (1) (mAU.s) Hàm lượng (%)
1 9,8 8861,65 1,30 2 10,4 9463,95 1,32 3 10 9009,08 1,30 4 10,6 9665,18 1,32 5 9,5 8519,61 1,29 6 10,2 9114,52 1,29 Trung bình 1,30 RSD (%) 0,99
+ Định lượng imperatorin trong cao chiết MeOH mẫu rễ củ bạch chỉ BC2.
Tiến hành định lượng mẫu phân tích BC2 với điều kiện sắc ký ĐK-BC. Hàm lượng chất phân tích được xác định theo đường chuẩn. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.11: Kết quả xác đinh hàm lượng imperatorin trong cao chiết MeOH mẫu BC2
STT Nồng độ mẫu phân tích
(mg/ml) Diện tích pic (1) (mAU.s) Hàm lượng (%)
1 10,5 27104,11 3,86 2 10 25941,43 3,88 3 9,8 2518,.2 3,84 4 10,3 26982,35 3,92 5 9,4 24545,04 3,90 6 9,6 24842,67 3,87 Trung bình 3,88 RSD (%) 0,73
Bảng 3.12: Kết quả định lượng imperatorin trong cao chiết MeOH của mẫu BC1 và BC2
STT Ký hiệu mẫu Hàm lượng imperatorin (%)
1 BC1 1,30
2 BC2 3,88
Kết quả nghiên cứu trong bảng 3.14 cho thấy: hàm lượng imperatorin giữa hai công thức nghiên cứu đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt, với mẫu BC2 công thức bón chế phẩm VH1 đã cho hàm lượng imperatorin là 3,88% cao gấp 3 lần so với mẫu BC1 không bón chế phẩm là 1,3%.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
Từ các mẫu đất và rễ của cây bạch chỉ chúng tôi đã phân lập được 11 chủng nấm với các màu sắc khuẩn lạc và hình thái khác nhau.
Đã tuyển chọn và định danh được 02 chủng nấm ngoại cộng sinh SH3 và SH4 có các đặc tính hữu hiệu cao để sản xuất chế phẩm.
Chủng SH3 là một chủng nấm thuộc loài Diaporthe phaseolorum.
Chủng SH4 là một chủng nấm thuộc loài Stemphylium lycopersici.
Đã nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu với 02 chủng nấm SH3 và SH4 là môi trường đậu tương, pH = 6 và thời gian 2 tuần.
Đã xây dựng được quy trình lên men phối trộn tạo chế phẩm nấm rễ VH1 ở quy mô phòng thí nghiệm. Chế phẩm an toàn cho người và động vật có thể dùng cho cây trồng.
Chế phẩm nấm rễ VH1 làm tăng đường kính rễ củ, khối lượng rễ củ của cây bạch chỉ do đó làm tăng năng suất thực thu của cây là 4,67 tấn/ha cao gấp 1,3 lần so với công thức không bón là 3,50 tấn/ha.
Công thức bón chế phẩm nấm rễ VH1 cho hàm lượng imperatorin là 3,88% cao gấp khoảng 3 lần so với công thức không bón chế phẩm là 1,30%.
4.2. KIẾN NGHỊ
Đề tài đã thu được một số kết quả khá khả quan, từ các kết quả đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm rễ làm tăng năng suất và chất lượng của cây thuốc. Kết quả này sẽ tạo tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm nấm rễ ở quy mô công nghiệp, tạo ra nguồn phân bón vi sinh không gây hại cho đất trồng, giảm giá thành sản phẩm và trong tương lai sẽ được áp dụng rộng rãi cho các vùng trồng cây thuốc tại Việt Nam.
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN VĂN
Trần Thị Như Hằng, Đỗ Hoàng Hải, Nguyễn Đình Luyện, Hoàng Kim Chi, Lê Mai Hương (2016). “Định tên và đánh giá hoạt tính sinh học một số chủng nấm rễ phân lập trên cây bạch chỉ”. Tạp chí Dược học số 2.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Đề án “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030”, tr. 30-33.
2. Đỗ Huy Bích và cs, Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật 2004.
3. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 1991.
4. Nguyễn Minh Châu, Lê Quốc Huy (2007), “Kết quả nghiên cứu áp dụng thử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang (Alginate beads) cho cây con sao đen (Hopea odorata)”, tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn số 18, tr. 81-86.
5. Phạm Quang Thu, Đặng Như Quỳnh (2008), “Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi và sự hình thành rễ nấm của một số loài nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn trong nuôi cấy thuần khiết”, tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn số 12 , tr. 84-90.
6. Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường, (2007). “Nghiên cứu sự đa dạng nấm cộng sinh Arbuscular mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ đất ô nhiễm chì”. Báo cáo khoa học về Sinh thái và Tài nguyên sinh vât, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, 1, tr. 216-221.
7. Trần Hùng, Kết quả di thực một số cây thuốc, Kỷ yếu công trình nghiên cứu 1961-1971 Viện Dược Liệu.
8. Trần Thị Minh Hằng, Nguyễn Hà Đăng, Phạm Văn Cường, Trần Thị Như Hằng, 2013. Ảnh hưởng của nấm rễ Mycorrhizae đến sinh
trưởng, năng suất và hiệu suất bón lân cho cây cà chua. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn (18), tr. 31-37.
9. Trần Thị Dạ Thảo, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (2007), ảnh hưởng của phân lân đến sinh trưởng, năng suất, sự tồn lưu dinh dưỡng và mật đọ nấm cộng sinh của bắp (Zea mays L.) trên vùng đất xám tỉnh Tây Ninh vụ Đông Xuân năm 2004-2005”, Tạp chí Khoa học kĩ thuật Nông Lâm Nghiệp (1&2), tr. 82-87.
10. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam. NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội.
TIẾNG ANH
11. Aanen D.K. (2006), “As you reap, so shall you sow: cloupling of harvesting and inoculating stabilizes the muatlism between termites and fungi” Biol Lett, 2, pp. 209-212.
12. Bi Guochang, Zang Mu, Guo Xiuzhen (1989), “Distribution of ectomycorrhizal fungi under several chief forest types in alpine coniferou region of northwestern yunnan”, Scientia Silvae Sinicae, 25(1), pp. 33-39.
13. Bohrer, K.E. & Amon, J.P. (2004). Seasonal dynamis of Arbuscular Mycorrhizal fungi in differing wetland habitats. Mycorrhiza 14, pp. 329-337.
14. Câmara, M. P., O’Neill, N. R., & Van Berkum, P. (2002), “Phylogeny of Stemphylium spp. Based on ITS and glyceraldehydes- 3-phosphate dehydrogenase gene sequences. Mycologia, 94(4), pp. 660-672.
15. Frank A.B. (1885), “Uber die auf Wurzelsymbiose beruhende Ehrnahrung gewisser Baum durch unterirdische Pilze”, Berichte der Deutschen botainschen Gesellschaft,3, pp. 128-145.
16. Gallo M.B.C., Guimarase D. O., Luciano da S. Momesso, Monica T. Pupo (2008), “Natural Products from Endophytic Fungi”, Microbial Biotechnology, pp. 139-168.
17. Grenville D.J, Piche Y., Peterson R.L. (1985), “Sclerotia as viable sources of mycelia for the establishment of ectomycorrhizae”,
Canadian Joural of microbiology, 31, pp. 1085-1088.
18. Guhardja E., “Rainforest ecosystems of East Kalimanta” (2000),
Springer, pp.1130- 1154.
19. Harvey, Linda M., (1991). “Cultural Techniques for Production of Ectomycorrhizal Fungi”. Biotechnology Advances. Vol. 9, pp. 12- 29.
20. Hartnett, D.C. and Wilson, G.W.T. (1999). Mycorrhizae influence plant community structure and diversity in tall grass prairie. Ecology. 80, pp. 1187-1195.
21. Huda S.M.S., Uddin M.B., Haque M.M., “Horizontal distribution of ectomycorrhizal infection in Dipterocarpus turbinatus plantations of Bangladesh”, 17(1), pp. 47-49.
22. J. Kang, L. Zhou, J. Sun, J. Han, D.-A. Guo. (2008),
Chromatographic fingerprint analysis and characterization of furocoumarins in the roots of Angelica dahurica by HPLC/DAD/ESI- MSn technique, J Pharm Biomed Anal,47(4-5), pp. 778-785.
23. James M. Trappe (2010), “Fungus associates of ectotrophic mycorrhizae”, Botanical Review, pp. 538-606.
24. Jan-Erik Nylund (1978), “ The ectomycorrhizal infection zone and its relation to acids polysaccharides of cortical cell walls”, New Phytologist, 106, pp. 505-516.
25. Lakshman, H.C. and Raghavendra, S. (1990). Occurrence of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi in medicinal plants. In: Proceedings of the Second National Conference on Mycorrhiza, Bangalore, 21-23 November, 1990. pp. 21-23.
26. Marx C., Dexheimer J., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. (1982),“Enzymatic Studies on the Metabolism of Vesicular- Arbuscular mycorrhizas”, New Phytologist, 90(1), pp. 37-43.
27. Mei-ling XU, Jiao-jun ZHU , Hong-zhang KANG, Jin-xin Zhang, Feng-qin Li (2008), “Optimun conditions for pure culture of maijor ectomycorrhizal fungi obtained from Pinus Sylvestris var. Mongolica platation in southeastern Keerpin sandy lands, China”,
Journal of Forestry Research , Springer, pp. 113-118.
28. Misra and Kaushik B.D (1989), “Growth promoting substances of Cyanobacteria II”, Detection of amino acids, sugar and auxins, Proc. India. Natn. Sci. Acad, 55, pp.499-504.
29. Redecker D., Kodner R., Graham L.E.2000, “Glomalean fungi from the Ordovician”, Science, 289, pp. 1920-1921.
30. Robson A.D., Abbott L.K., Malajczuk N (1994), “Management of mycorrhizas in agriculture horticulture and forestry”, Kluwer Academic, pp. 112-124.
31. Russell J., Rodriguez Regina S. redman Joan M. Henson (2005), “ Symbiotic Lifestyle Expression by Fungal Endophytes and the Adaption of plants to Stress: Unraveling the Complexities of Intimacy”, Taylor & francis Group, LLC 34, pp. 683-695.
32. S.E Smith. and D.J. Read (1997), “Mycorrhizal Symbiosis” (2nd Edition). Academic Press: London, UK, 2, pp. 605
33. Selvaraj, T. and Subramanian, G. (1990). Incidence of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi in medicinal plants. In-Proceedings of the Second National Conference on Mycorrhiza, Bangalore, 21-23 November, 1990. pp. 34-35.
34. Shela G., Olga M.B., Elen K., (2003), “Comparison of the contents of the main biochemical”, Journal of nutritional Biochemistry, 14, pp. 154-159.
35. Simard, S.W., Perry, D.A. and Jones, M.D., (1997). Net transfer of carbon between ectomycorrhizal tree species in the field. Nature 388, pp. 579-582.
36. Tejavathi, D. H., Anitha, P., Savitha M. Murthy and Nijagunaiah, R. (2011). Effect of AM fungal association with normal and micropropagated plants of Andrographis paniculata Nees on biomass, primary and secondary metabolites. International Research Journal of Plant Online International Interdisciplinary Research Journal, {Bi- Monthly}, Volume-II, Issue-II, Mar-Apr2012 Science. Vol. 2(12) pp. 338-348.
37. Tian Chengming, Yang Junxiu, Liang Yingmei, Mo Yande (1995), “the Pharmaceutical fungi Resources and Ecological distribution in the Qingling mountain”, Journal of northwest forestry college, pp. 04-05.
38. Trappe, J.M. (1987). Phylogenetic and ecological aspects of mycotrophy in the angiosperms from an evolutionary stand point. In: Ecophysiology of VA mycorrhizal plants (Eds), Safir, G.R., Academic Press, New Yark. pp. 5-25.
39. Turmel. M.S.,(2004). “Exposing the Mycorrhizaes in Agriculture” University of Manitoba, Winnipeg, MB R3T 2N2.
40. Vanden B.D.A., Vlietlinck A.J.,(1991), “Methods in Plant Biochemistry”, Academic press , NewYork.
41. Vestberg M., Saari K., Kukkonen S., Hurme T., (2005). ”Mycotrophy of crops in rotation and soil amendment with peat influence the abundance and effectiveness of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi in field soil”. Mycorrhiza 15(6), pp. 447-458.
42. Y. Chen, Y. Jin, Y. Chen, Y. Jin, X. Liu, L. Wang (2009). A Novel
HPLC Method to Analyze Imperatorin and Isoimperatorin of Angelica dahurica Oils Obtained by Supercritical Fluid Extraction, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 32(16), pp. 2384- 2395.
43. Warner, A. and B. Mosse (1980). Independent spread of Vesicular Arbuscular Mycorrhizal fungi in soil, Trans. British Mycol. Soc., 74, pp. 407-410.
44. Zhao, Z.W., Qin, X.Z., Li, X.W., Cheng, L.Z., Sha, T. and Wang, G.H., (2001). Arbuscular mycorrhizal status of plants and the spore density of arbuscular mycorrhizal fungi in the tropical rain forest of Xishuangbanna, southwest China. Mycorrhiza 11, pp. 159-162.
TRANG WEB
45. http://www.oiirj.org/oiirj/mar2012/12.pdf
46. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/imperatorin#sectio n=Biological-Test-Results
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1
Hình ảnh phân lập các chủng nấm
PHỤ LỤC 2
Cây phân loại chủng SH3
Vị trí phân loại của chủng SH3 với các loài có quan hệ họ hàng gần.
Leucostoma cinctum_AF191170 Diaporthe viticola_AY485750 Diaporthe medusaea_JQ807444 Diaporthe australafricana_AF230744 100 Phomopsis amygdali_GQ281791 100
Diaporthe alleghaniensis_FJ889444 Diaporthe vaccinii_AY952141 Phomopsis cotoneastri_FJ889450 Diaporthe perniciosa_HQ908492 Diaporthe eres_EU805539 100 57 78 82 100
Diaporthe hongkongensis_KC343119 Diaporthe hickoriae_FJ889446 Diaporthe neotheicola_EU814480
54
74 Diaporthe perjuncta_AY485785
Diaporthe strumella var. longispora_FJ889449 Phomopsis sclerotioides_AF439626
Diaporthe ambigua_AF230767 Diaporthe helianthi_EU878427 Diaporthe lusitanicae_EU814477 Diaporthe phaseolorum_JF896458 Diaporthe sojae_KJ590720
58
51 SH3_
Phomopsis subordinaria_GQ922519 Diaporthe stewartii_FJ889448 Diaporthe angelicae_AY196779
Phomopsis dauci_FJ889451 64 100 Phomopsis cuppatea_AY339322 93 Diaporthe melonis_FJ889447 57 Phomopsis longicolla_HQ333500 50 65 58 95 87 89 0.02
Cây phân loại chủng SH4
Vị trí phân loại của chủng SH4 với các loài có quan hệ họ hàng gần.
Curvularia papendorfii_KJ90977 SH4 Stemphylium subglobuliferum_AY751454 Stemphylium xanthosomatis_AY329206 100 Stemphylium lycopersici_JF417683 99 Stemphylium lancipes_AY329203 Stemphylium callistephi_AF442783 Stemphylium solani_AF203448 76 Stemphylium botryosum_AY329168 Stemphylium eturmiunum_AY329230 Stemphylium trifolii_AY329218 Stemphylium loti_AY32927 Stemphylium paludiscirpi_AY329231 Stemphylium triglochinicola_AY329175 70 92 Stemphylium majusculum_AY329228 Pleospora gigaspora_AY329177 Stemphylium astragali_AF442779 61 Stemphylium herbarum_AY329169 Stemphylium alfalfae_AF442775 Stemphylium vesicarium_AF442803 Stemphylium sedicola_AY329232 Stemphylium tomatonis_AY329229 50 59 60 57 66 71 56 80 58 100 0.01
PHỤ LỤC 3
Bảng theo dõi động thái sinh trưởng của cây bạch chỉ
Ngày theo dõi
Chiều cao cây (cm) Số lá (lá) Đường kính tán (cm) VH1 ĐC VH1 ĐC VH1 ĐC 27/1/2015 Ngày trồng 15,33 16,44 4,20 4,30 28/2/2015 22,44±0,82 22,78±1,95 5,36±0,38 5,53±0,65 19,06±0,48 20,19±1,29 28/3/2015 53,26±3,67 47,71±5,90 5,39±0,35 5,67±0,33 43,11±1,02 45,97±1,39 28/4/2015 83,67±2,52 82,67±2,91 5,00±0,33 4,22±0,38 56,33±3,61 61,11±3,15 28/5/2015 88,17±1,96 87,33±2,31 6,22±1,35 5,78±0,19 65,00±6,56 60,56±3,37 28/6/2015 Thu hoạch 88,77±2,11 87,60±5,11 4,53±0,52 4,31±0,64 59,90±5,24 55,80±3,38
Bảng theo dõi động thái sinh trưởng của bộ rễ củ cây bạch chỉ Ngày theo dõi Chiều dài rễ củ (cm) Đường kính rễ củ (cm) Khối lượng rễ củ khô (g) Tỷ lệ rễ củ Tươi/khô VH1 ĐC VH1 ĐC VH1 ĐC VH1 ĐC 27/1/2015 Ngày trồng 28/2/2015 4,81± 0,4 5,29± 0,8 0,87± 0,03 0,85± 0,04 0,40± 0,05 0,54± 0,02 4,18± 0,28 3,84± 0,06 28/3/2015 12,3± 1,85 13,44± 1,38 1,96± 0,14 1,55± 0,09 2,35± 0,25 1,70± 0,69 7,69± 1,02 7,52± 0,37 28/4/2015 16,19± 3,07 15,3± 3,46 3,79± 0,24 2,98± 0,31 33,76± 3,42 19,83± 9,41 3,01± 0,54 3,48± 0,68 28/5/2015 21,56± 3,68 20,11± 1,83 4,07± 0,42 3,50± 0,29 66,89± 15,08 55,89± 15,2 2,67± 0,42 2,55± 0,12 28/6/2015 Thu hoạch 22,83± 1,71 22,8± 2,10 4,87± 0,35 4,69± 0,16 87,17± 6,92 77,67± 5,33 2,53± 0,18 2,73± 0,19
Phổ sắc ký đồ mẫu chất chuẩn imperatorin nồng độ 500µg/ml (a) và dịch chiết MeOH mẫu rễ củ bạch chỉ BC1 nồng độ 10mg/ml (b)
Phổ sắc ký đồ mẫu chất chuẩn imperatorin nồng độ 500µg/ml (a) và dịch chiết MeOH mẫu rễ củ bạch chỉ BC2 nồng độ 10mg/ml (b)
PHỤ LỤC 4