Hoạt chất imperatorin có tên gọi theo IUPAC là 9-(3-methylbut-2- enyloxy)-7H-furo[3,2g] chromen-7-one.
Công thức phân tử: C16H14O4
Khối lượng phân tử: 270.27996 g/mol
Hoạt chất này có mặt trong thành phần hóa học của cây bạch chỉ -
Angelica dahurica, cây xà sàng - Cnidium monnieri, cây sa sâm bắc - Glehnia littoralis. [2]
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Imperatorin
Các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hoạt chất này có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào và gây giáng hóa nhiều loại tế bào. Ngoài ra người ta cũng phát hiện Imperatorin có tác dụng trong quá trình hình thành xương, kháng viêm, kháng quá trình phiên mã ngược của HIV-1, tác dụng
giãn mạch máu. Các nghiên cứu gần đây cho thấy imperatorin là một chất chẹn kênh calci, ngăn cản dòng Ca++ đi qua kênh, chầm vào tế bào thần kinh dãn truyền và tế bào cơ tim (tác dụng chống loạn nhịp tim) và vào tế bào cơ trơn thành mạch (tác dụng giãn mạch). Những nghiên cứu này đã sử dụng đối chứng dương là thuốc verapamil một thuốc có tác dụng giảm tiêu thụ oxygen của cơ tim trực tiếp bằng cách can thiệp vào quá trình chuyển hoá tiêu thụ oxygen của cơ tim, làm tăng lưu lượng máu động mạch vành và ngăn cản co thắt động mạch vành. Kết quả nghiên cứu invivo và in vitro hợp chất Imperatorin cho thấy đây là nguyên liệu tiềm năng trong phát triển thuốc hạ huyết áp.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Đất và rễ cây Bạch chỉ
Các mẫu đất và rễ cây Bạch chỉ được lấy tại Hưng Yên và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học và các Hợp chất thiên nhiên.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
2.1.2.1. Hóa chất
Các hóa chất thực hiện thí nghiệm có nguồn gốc từ: Đức, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ,…
Các dung môi để tách chiết hợp chất từ dịch môi trường nuôi cấy như etylaxetat, methanol, ethanol.
2.1.2.2. Thiết bị phòng thí nghiệm
+ Tủ cấy vi sinh - Box laminar PH (Đức) + Tủ ấm 30oC, 37oC – Memmert (Đức) + Cân điện tử AL300 – Thụy sỹ
+ Nồi khử trùng Lequenx (Pháp)
+ Kính hiển vi điện tử Olympus (Nhật Bản) + Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)
+ Rây ướt các kích thước khác nhau 120µm, 60µm, 45µm, 32µm.
+ Các dụng cụ cấy VSV (Việt Nam, Thụy Sỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ…)
2.1.3. Môi Trường
2.1.3.1. Môi trường phân lập nấm vùng rễ
Môi trường MMN (g/L): Glucose 10g; (NH4)2PO4 0,25g; MgSO4.7H2O 0,0732g; KH2PO4 0,5g; CaCl2 0,0662g; NaCl 0,025g; FeCl3.6H2O 0,02g; Thiamine HCl 1x10-4g. Bổ sung kháng sinh sau khi khử trùng: 10ml chloramphenicol 0,5% và 10ml chlotetracycline 0,5%.
2.1.3.2. Môi trường nuôi cấy, lên men và giữ giống.
+ Môi trường thạch - khoai tây (g/L): Khoai tây 200g (bỏ vỏ, thái nhỏ, đun sôi, lọc lấy dịch); Đường 20g; Thạch 15g. Khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
+ Môi trường khoai tây dịch thể (g/L): Khoai tây 200g (bỏ vỏ, thái nhỏ, đun sôi, lọc lấy dịch); Đường 20g; Pepton 5g. Khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
+ Môi trường Czapek-Dox (g/L): Saccharose 30g; NaNO3 2g; KH2PO4
1g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g ; FeSO4.7H2O 0,01g; pH = 6 (chỉnh bằng HCl). Khử trùng ở 121 oC trong 30 phút.
+ Môi trường Sabouraud (g/L): Pepton 10g; Glucose 20g. Khử trùng ở 110 oC trong 30 phút.
+ Môi trường nước chiết cám (g/L): Cám gạo 100 (đun sôi trong 20 phút, lọc lấy dịch); Saccharose 30g; NaNO3 2g; KH2PO4 1g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g. Khử trùng ở 121 oC trong 30 phút.
+ Môi trường bột đậu tương (g/L): Bột đậu tương 20g; NaNO3 3g; K2HPO4 1g; MgSO4 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4 0,1g; Glucose 20g; (pH= 5,5- 6). Khử trùng ở nhiệt độ 110 oC trong 30 phút.
2.1.3.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme
Môi trường thử hoạt tính enzyme phosphataza: 200ml dung dịch khoáng; Glucose 2g; Cao nấm men 0,1g; Thạch 4g. Khử trùng ở 110oC trong 30 phút.
(Thành phần dung dịch khoáng bao gồm (g/L): Ca3(PO4)2 5g; (NH4)2SO4 0,5g; KCl 0,2g; MgSO4.7H2O 0,1g; MnSO4.4H2O 0,001g; FeSO4.7H2O 0.001g.)
2.1.3.4. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát khó tan
Môi trường Pikovskaya (g/L): Glucose 10g; Ca3(PO4)2 5g; (NH4)2SO4
0,5g; NaCl 0,2g; MgSO4.7H20 0,1g; KCl 0,2g; Cao nấm men 0,5g; MnSO4
vết; FeSO4.7H20 vết; Thạch 12g. Khử trùng ở 110oC trong 30 phút.
2.1.3.5. Môi trường đánh giá khả năng sinh IAA
Các chủng được lựa chọn sẽ được đánh giá khả năng sinh chất kính thích sinh trưởng theo phương pháp Salkowsky cải tiến củaMisra và Kaushik B.D. 1989. Môi trường dùng nuôi cấy vi sinh vật có công thức (g/L): Difco peptone 20g; K2HPO4 1,15g; MgSO4 1,5g; Glycerol 1,5% (v/v), tryptophan 0,1%. Thuốc thử cải tiển có thành phần FeCl3 0,5M 15ml; H2SO4 98% 300ml; nước cất 500ml.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập
2.2.1.1. Thu thập mẫu
Gạt bỏ 3cm đất bề mặt để loại trừ thảm mục thực vật. Dùng xẻng đã được vô trùng bằng cồn đào lấy phần bầu đất quanh rễ cây (ở độ sâu 0-20cm). Đào lấy rễ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non. Mẫu đất sau khi được thu
thập về để khô tự nhiên tránh môi trường ô nhiễm và riêng biệt, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2-5oC) trước khi sử dụng cho phân lập hoặc đồng nuôi cấy.
2.2.1.2. Phân lập các chủng nấm
Phân lập rễ: Theo phương pháp của Harvey, Linda M. 1991 [19].Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Khi bề mặt mẫu đã ráo nước, ngâm mẫu trong cồn 70o trong 1 phút. Để mẫu khô trong tủ cấy vô trùng. Dùng dụng cụ vô trùng cắt mẫu rễ thành những đoạn nhỏ dài từ 5-10mm, đặt các đoạn đó trên đĩa Petri có môi trường phân lập (môi trường MMN), sau đó chuyển vào tủ ấm 30oC trong thời gian 48-72 giờ.
Phân lập mẫu đất: Lấy 1g đất đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã vô trùng, lắc đều, dùng pipet hút 100l dịch nhỏ vào đĩa petri có môi trường phân lập (môi trường MMN), sau đó chuyển vào tủ ấm 30°C.
Lựa chọn và lưu giữ giống từ các sợi nấm mọc ra từ các mô rễ cây và đất ở các đĩa phân lập, ria cấy trên môi trường MMN để tinh sạch chủng. Lựa chọn các chủng sạch để cấy trên môi trường thạch nghiêng MMN hoặc khoai tây cho việc lưu giữ giống và kiểm tra hoạt tính để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Chủng nấm được bảo quản, trước khi mang ra sử dụng cần được cấy truyền sang ống thạch nghiêng để được hoạt hóa.
2.2.2. Tuyển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm nghiệm
2.2.2.1. Xác định hoạt khả năng hoà tan phosphat canxi của các chủng nấm phân lập
Khả năng hoà tan phosphat canxi được xác định theo nguyên lý khuếch tán trên thạch, bằng phương pháp khoan lỗ thạch; dịch nuôi nấm đã loại bỏ tế bào được đưa vào các lỗ đục trên đĩa thạch đã chứa các cơ chất tương ứng. Các đĩa có lỗ thạch được để trong tủ lạnh 1-2h, rồi để trong tủ ấm 18-24h, để
dịch nuôi nấm khuếch tán và tác dụng với cơ chất. Các vùng có khả năng hoà tan phosphat canxi là những quầng trong suốt xung quanh lỗ thạch. Đường kính của vùng phân hủy (mm) biểu thị hoạt độ khả năng hoà tan phosphat canxi dịch nuôi nấm.
2.2.2.2. Xác định hoạt tính phân giải phốt phát khó tan của các chủng nấm lựa chọn
Khả năng phân giải phốt phát của vi sinh vật được xác định bằng phương pháp định lượng phốt pho hữu hiệu (hòa tan) trong dịch nuôi cấy
[TCVN 8565:2010]. Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy lắc trong môi trường Pikovskaya trong 7-10 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút, gạn lấy phần nước trong; Hàm lượng phốt pho trong dung dịch chiết được xác định bằng phương pháp trắc quang sau khi đã phân huỷ gốc xitrat. Đo màu xanh molipden do phản ứng của phốt pho với molypdat tạo thành phức đa dị vòng có màu xanh khi bị khử, từ đó suy ra hàm lượng phốt pho hữu hiệu (hòa tan) trong mẫu.
2.2.2.3. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp Indole-3-acctic acid (IAA) của các chủng nấm lựa chọn
Các chủng sẽ được đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA theo phương pháp Salkowsky cải tiến của Misra và Kaushik B.D. 1989. [28]
Vi sinh vật được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút tại 30oC trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được dùng để xác định hàm lượng IAA trong mẫu. Bổ sung 2ml dịch mẫu vào 8ml thuốc thử cải tiến và lắc đều. Để yên trong 20 phút, sau đó so màu ở bước sóng quang 530nm. Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến đỏ, tùy theo hàm lượng chất IAA có trong dịch nuôi cấy.
2.2.2.4. Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng nấm lựa chọn
Với mục đích tạo ra dạng chế phẩm có chứa hỗn hợp các vi sinh vật sống (nấm rễ) có khả năng phân giải các hợp chất phốt phát khó tan và tăng kích thích sinh trưởng của cây trồng. Tất cả các chủng phân lập được nuôi cấy trên một môi trường dinh dưỡng, các chủng được thử theo từng cặp quan sát sự sinh trưởng của chúng. Nếu 2 chủng không đối kháng hay ức chế sự phát triển lẫn nhau mà vẫn đảm bảo được hoạt tính thì có thể kết luận được sự sinh trưởng và sản phẩm trao đổi chất của chủng này không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như các chất trao đổi của chủng kia.
2.2.3. Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử
Tách ADN từ nấm: ADN từ sinh khối các chủng nấm nghiên cứu được tách theo quy trình CTAB của Doyle & Doyle (1987). []
Khuếch đại vùng trình tự ITS của rADN các chủng nấm nghiên cứu: + Khuếch đại vùng trình tự ITS bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS1 (5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3') và ITS4 (5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3') sử dụng chương trình ADN barcodes.
+ Hỗn hợp phản ứng: 10X Buffer 10µl; dNTP mixture 16µl; TaqTm 1.2µl; Mẫu ADN (50 ng) 1µl; Mồi xuôi 2µl; Mồi ngược 2µl; Nước cất 100µl.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1.5% và tinh sạch bằng Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Đức). Sản phẩm này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều với mồi ITS1/ITS4. Đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer ( Applied Biosystems, Mỹ).
Xây dựng cây phân loại sử dụng phần mềm Bioedit v7.0.5.2, ClustalW 1.83.
2.2.4. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng nấm đã lựa chọn
2.2.4.1. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp của các chủng nấm lựa chọn
Hoạt hóa các chủng nấm bằng cấy chuyển ra đĩa petri với môi trường thạch - khoai tây. Khi hệ sợi của nấm phát triển khắp bề mặt của đĩa thạch, tiến hành cấy chuyển giống sang 5 môi trường dịch thể: Czapek-Dox, khoai tây, đậu tương, nước chiết cám và Sabouraud. Sau 2 tuần nuôi cấy thu sinh khối để từ đó tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho sự phát triển của chủng nấm.
2.2.4.2. Xác định khoảng pH môi trường nuôi cấy thích hợp của các chủng nấm lựa chọn
Các chủng nấm được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp với dải pH từ 3-8. Dùng NaOH và HCl để chỉnh độ pH thích hợp. Sau 2 tuần thu sinh khối từ đó tìm ra giá trị pH thích hợp nhất cho phát triển của chủng nấm.
2.2.4.3. Xác định khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp của các chủng nấm lựa chọn
Các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường thích hợp với giá trị pH thích hợp trong khoảng thời gian khác nhau: 1, 2, 3, 4, 5 tuần. Sau đó tiến hành so sánh sinh khối của các tuần để xác định được khoảng thời gian thích hợp nhất cho sự phát triển của chủng nấm.
2.2.5. Tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm.
2.2.5.1. Lên men các chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi đưa ra sơ đồ lên men các chủng vi sinh vật quy mô phòng thí nghiệm.
Hình 2.1: Quy trình lên men tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm Các chủng nấm đã hoạt hoá
Nhân giống cấp I
(Từng chủng riêng lẻ, lắc ổn nhiệt và trên môi tường dịch thể)
Nhân giống cấp II
(Từng chủng riêng lẻ trên bình 2L có sục khí, lắc ổn nhiệt và trên môi trường dịch thể)
Lên men trên thiết bị lên men 15L
(Sục khí, pH và môi trường tối ưu)
2.2.5.2. Quy trình phối trộn tạo chế phẩm quy mô phòng thí nghiệm
Hình 2.2: Quy trình sản xuất chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm
2.2.6. Thử nghiệm chế phẩm trên cây bạch chỉ
2.2.6.1. Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ
Các thí nghiệm đồng ruộng tiến hành tại: Trung tâm NC trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội.
Sản phẩm lên men dịch thể
(cho từng chủng riêng rẽ)
Sản phẩm phối trộn của các chủng
Phối trộn với chất mang
(Vlên men: Wchất mang=1:2) Sấy 400C, độ ẩm 10% Trộn với than bùn (1:1) Đóng gói, bảo quản chế phẩm rắn (Mật độ: 108 VSV)
+ Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Công thức 1: Bón chế phẩm VH1
Công thức 2: Không bón chế phẩm VH1 (đối chứng)
Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB), ba lần nhắc lại. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 30m2. Diện tích thí nghiệm là 360m2 (bao gồm các luống trồng bảo vệ).
+ Các chỉ tiêu theo dõi tác động của chế phẩm đến năng suất cây bạch chỉ:
Chỉ tiêu sinh trưởng:
- Ngày gieo
- Thời gian từ gieo đến mọc (ngày) - Thời gian từ gieo đến trồng (ngày) - Chiều cao cây (cm)
- Số lá (lá/cây)
- Đường kính tán (cm)
Chỉ tiêu sinh trưởng rễ củ và năng suất rễ củ bạch chỉ:
- Chiều dài rễ củ (cm) - Đường kính rễ củ (cm) - Khối lượng rễ củ/cây (g) - Tỷ lệ rễ củ tươi/khô.
- Năng suất lý thuyết (tấn/ha) - Năng suất thực thu (tấn/ha)
+ Phương pháp theo dõi:
- Thời gian từ gieo đến mọc (ngày): Tính từ ngày gieo đến ngày hạt mọc 50%.
- Thời gian từ gieo đến trồng (ngày): Tính từ ngày gieo đến ngày đánh trồng cây con.
- Thời gian sinh trưởng (ngày): Tính từ ngày gieo đến ngày thu hoạch dược liệu.
- Chiều cao cây (cm): Sử dụng thước có độ chính xác đến 10-1cm để đo. Chiều cao cây được xác định ở đây là chiều cao vuốt lá. Khi đo vuốt lá thẳng lên và đo.
- Số lá: Đếm số lá của cây tại các thời điểm khác nhau và khi thu hoạch. - Đường kính tán (cm): Dùng thước có độ chính xác đến 10-1cm. Tiến hành đo đường kính tán cây theo hướng: Đông - Tây và Nam - Bắc sau đó cộng lại và lấy giá trị trung bình, đó là đường kính tán của cây.
- Chiều dài rễ củ (cm): Dùng thước có độ chính xác đến 10-1cm, đo từ gốc đến chóp rễ củ (phía cuối của rễ củ dài nhất trong khóm).
- Đường kính rễ củ (cm): Dùng thước có độ chính xác đến 10-1cm để đo, đo tại phần đầu rễ củ.
- Khối lượng rễ củ/cây (g): Sau khi thu hoạch loại bỏ hết đất, cát bám vào rễ củ cây. Tiến hành cân khối lượng rễ củ/cây.
- Năng suất lý thuyết (tấn/ha):
NNSLT = Khối lượng rễ củ/cây (g) x Mật độ (cây/ha) - Năng suất thực thu (tấn/ha):
NNSTT = Năng suất thực thu/sào
x 10.000 360m2
- Tỷ lệ củ Tươi/khô:
C = Khối lượng rễ củ tươi Khối lượng rễ củ khô
2.2.6.2. Nghiên cứu tác động của chế phẩm đến hàm lượng chất imperatorin của rễ củ cây bạch chỉ sau khi thu hoạch
Xác định hàm lượng hợp chất imperatorin trong mẫu rễ củ cây bạch chỉ của 2 công thức thí nghiệm bằng phương pháp HPLC-DAD.
+ Nguyên liệu: 2 mẫu rễ củ cây bạch chỉ khô:
BC1: rễ củ cây bạch chỉ không bón chế phẩm VH1 (đối chứng). BC2: rễ củ cây bạch chỉ bón chế phẩm VH1.
+ Hóa chất, thiết bị:
- CH3OH dùng cho HPLC (Merck). - CH3CN dùng cho HPLC (Merck). - Nước cất tinh khiết.
- Chất chuẩn: Imperatorin tinh khiết (Merck)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, detector DAD.
- Cân phân tích Ohaus-USA độ chính xác 0,0001g - Vial, bình định mức các loại.
- Micropipette có độ chính xác phù hợp.
+ Phương pháp phân tích:
Chiết mẫu thực vật:
Cân khoảng 2 gam mẫu rễ củ bạch chỉ khô, chiết siêu âm trong 50ml