STT KH chủng SH1 SH2 SH3 SH4 1 SH1 + + + 2 SH2 + + + 3 SH3 + + + 4 SH4 + + + (+): Không đối kháng.
Kết quả bảng 3.4 cho thấy các chủng nấm không đối kháng nhau. Như vậy căn cứ vào hoạt tính enzyme phosphataza, khả năng phân giải phốt phát khó tan, khả năng sinh tổng hợp IAA và khả năng đối kháng giữa các chủng chúng tôi đã lựa chọn được 2 chủng nấm SH3 và SH4 có những đặc điểm hoạt tính có lợi cho cây trồng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Định danhcác chủng nấm bằng sinh học phân tử
Trình tự rDNA vùng ITS của chủng SH3:
GCGCTTCGGCGCACCCAGAAACCCTTTGTGAACTTATACCT ACTGTTGCCTCGGCGCAGGCCGGCCTCTTCGCTGAGGCCCCCTGG
AGACAGGGAGCAGCCCGCCGGCGGCCAACTAAACTCTTGTTTCTT TAGTGAATCTCTGAGTAAAAAACATAAATGAATCAAAACTTTCAA CAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT TTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGT TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCAC TGCTCTCTAGCGGGAGCAGGCCCTGAAATCTAGTGGCGAGCTCGC CAGGACCCCGAGCGTAGTAGTTATATCTCGTTCTGGAAGGCCCTG GCGGTGCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAAAATTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC GGAGGAAAA.
Kết quả so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự rDNA vùng ITS chủng SH3 tương đồng 97.35% (514/528 bp) với trình tự rDNA vùng ITS của Phomopsis longicolla_HQ333500, tương đồng 97.7% (508/520 bp) với Diaporthe melonis_FJ889447. Và đặc biệt, khi so sánh trên ngân hàng gen của nhóm chi Diaporthe, chủng SH3 tương đồng 99% (540/543 bp) với chủng Diaporthe phaseolorum_ZJ4. Như vậy, có thể nói SH3 là một chủng nấm thuộc loài Diaporthe phaseolorum, một loài nấm kí sinh thực vật tương đối phổ biến nhưng lần đầu tiên được phân lập từ vùng rễ của cây bạch chỉ.
Trình tự rDNA vùng ITS của chủng SH4:
GCGGGCTGGGACCTTACTTCGGTGAGGGCTCCAGCTTGTCT GAATTATTCACCCATGTCTTTTGCGCACTTCTTGTTTCCTGGGCGG GTTCGCCCGCCACCAGGACCAAACCATAAACCTTTTTGTAATTGC AATCAGCGTCAGTAAACAATGTAATTATTACAACTTTCAACAACG GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT ACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA
CGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAG CGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCT CTCACGAGACTCGCCTTAAAATCATTGGCAGCCGACCTACTGGTT TCGGAGCGCAGCACAATTCTTGCACTTTGAATCAGCCTTGGTTGA GCATCCATCAAGACCCTATTTTTTTTAACTTTTGACCTCGGATCAG GTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA AA.
Kết quả so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự rDNA vùng ITS chủng SH4 tương đồng 100% (445/445 bp) với trình tự rDNA vùng ITS của Stemphylium lycopersici_JF417683, Stemphylium xanthosomatis_AY329206 và Stemphylium subglobuliferum_AY751454. Nghiên cứu của Câmara và các cộng sự về phân loại học của các loài thuộc chi Stemphylium đã khẳng định sự trùng lặp về trình tự ITS của 3 loài nói trên, tuy nhiên khi xét một số đặc điểm hình thái như kích thước và hình dáng bào tử nấm chủng SH4, có thể đi đến kết luận rằng SH4 là một chủng nấm thuộc loài Stemphylium lycopersici. [14]
3.4. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng nấm lựa chọn để tạo chế phẩm tạo chế phẩm
Trong phần lớn các trường hợp như nhiệt độ, pH, thành phần môi trường nuôi, thời gian nuôi là những yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến sự tích lũy sinh khối của nấm.
Dưới đây chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng lựa chọn cho chế phẩm.
3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường lên men
2 chủng nấm được nuôi trên 5 môi trường: Czapek-Dox, khoai tây, đậu tương, nước chiết cám, và Sabouraud. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát
triển của 2 chủng nấm qua trọng lượng sinh khối khô sau 2 tuần nuôi cấy. Trọng lượng sinh khối khô của 2 chủng được trình bày trong bảng 3.5:
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường lên men đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm lựa chọn
STT KH
chủng
Trọng lượng sinh khối khô (g/l)
Sabouraud Khoai tây Đậu tương Czapek- dox
Nước chiết cám
1 SH3 3,4 8,7 13,5 8,3 12,0
2 SH4 1,9 7,5 11,6 9,2 10,2