5.1.1. Nguyên tắccủa phƣơng pháp phân tích di truyền
Nhƣ đã biết phân tích lai là phƣơng pháp cơ bản và đặc thù của di truyền học. Phƣơng pháp nàybao gồm việc tiến hành lai và nghiên cứu sự di truyền các tính trạng và tính chất riêng rẽ ở cơ thể lai qua các thế hệ. Con cái thu đƣợc từ phép lai các dạng bố mẹ khác nhau về các tính trạng và tính chất di truyền gọi là con lai, còn quá trình thu nhận các con lai gọi là sự lai.
Gregor Mendel là ngƣời đầu tiên đã tiến hành các thí nghiệm về lai hữu tính trên thực vật vào những năm 1856 – 1865, cụ thể là ở đậu Hà Lan. Ông theo dõi tỷ mỉ sự biểu hiện các tính trạng của các dạng bố mẹ, đem lai ở các thế hệ lai kế tiếp nhau và đã rút ra những quy luật cơ bản đặt nền móng cho sựra đời của di truyền học sau này. Sở dĩ Mendel thu đƣợc kết quả nhƣ vậy vì ông đã không đi theo phƣơng pháp nghiên cứu của các tác giả đƣơng thời, mà tiến hành với các phƣơng pháp nghiên cứu riêng, độc đáo của mình và sau đóđã trở thành cơ sở của phƣơng pháp phân tích di truyền:
1. Để lai cần chọn các bố mẹ khởi đầu là những cây thuần chủng (đƣợc chọn lọc qua nhiều đời tự thụ phấn, các tính trạng nghiên cứu đã đƣợc ổn định) phân biệt theo
một số tính trạng tƣơng phản rõ nét. Khi tiến hành lai và theo dõi qua các thế hệ, ông chỉ chú ý đến cặp tính trạng tƣơng phản quan tâm, bỏ qua các tính trạng khác.
2. Trong mỗi thế hệ lai, cần nghiên cứu mỗi cặp tính trạng tƣơng phản một cách
riêng rẽ,không tính đến những sai khác giữa các cây lai.
3. Sử dụng toán thống kê để tính toán một cách chặt chẽ số lƣợng các con lai theo từng tính trạng tƣơng phản ở các thế hệ.
4. Tiến hành phân tích di truyền các tính trạng ở con lai theo từng cá thể một cách riêng rẽ qua các thế hệ.
Sau khi phân tích các thí nghiệm, Mendel đã rút ra các quy luật cơ bản về sự truyền đạt các tính trạng qua các thế hệ, đó là sự di truyền theo các nhân tố tách biệt (không phải theo tính chất hòa hợp nhƣ trong thuyết Pangen của Darwin). Điều đó nói lên tính trạng đƣợc kiểm tra bởi nhân tố di truyềnmà sau này đƣợc gọi là gen.
Mặc dù chƣa có những minh chứng về tính kế thừa vật chất di truyền qua các thế hệ, nhƣng Mendel đã tiên đoán về quy luật này. Đó là giả thuyết của ông về nhân tố di truyền tồn tại theo một ở giao tử và tồn tại theo hai ở cơ thể, từ đó đã đƣa ra các sơ đồ diễn giải các quá trình di truyền. Khoa học về sau đã phát hiện ra đôi nhiễm sắc thể tƣơng đồng và cơ sở kế thừa vật chất di truyền qua các thếhệ.
Những đóng góp to lớn của Mendel thể hiện ở sự thiết lập các quy luật cơ bản về sự di truyền và đặt nền móng cho phát triển di truyền hiện đại. Ngày nay trong phân tích
di truyền các tính trạng nhân loại vẫn tuân thủ và thực hiện theo các đặc điểm của phƣơng pháp phân tích di truyền mà Mendel đƣa ra.
Các kí hiệu thƣờng đƣợc sử dụng trong phân tích di truyền: – P – bố mẹ. Mẹ kí hiệu ♀, bố kí hiệu ♂.
– Lai hữu tính kí hiệu bằng dấu nhân (x), trong sơ đồ lai thƣờng viết mẹ trƣớc bố sau.
– F –chỉ thế hệ con lai, các chỉ số F1, F2…Fn là các thế hệ thứ nhất, thứ hai,… thứ n.
– Con lai lai lại với bố mẹkí hiệu Fb.
5.1.2. Nguyên tắc về kỹ thuật lai ở một số cây trồng
5.1.2.1. Nguyên tắc chung
Kỹ thuật lai ở thực vật đƣợc thực hiện bằng việc đƣa phấn lên nhụy hoa do con ngƣời tiến hành. Kỹ thuật chi tiết của việc lai tạo thƣờng là khác nhau và có đặc trƣng riêng, phụ thuộc vào từng đối tƣợng cụ thể. Nhƣng kỹ thuật lai của các loại cây trồng đều bao gồm các bƣớc: Chọn cặp bố mẹ và chuẩn bị cây lai; khử đực và bao cách ly và
thụ phấn.
a. Công việc chuẩn bị cho lai
Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết nhƣ: Panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách ly, lọ/túi
màu đen đựng hạt phấn. Bao cách ly có thể đƣợc làm từ giấy dầu hay những mảnh polyetylen cắt theo hình chữ nhật với kích thƣớc cần thiết. Gấp đôi, gấp các mép và dán hay khâu lại đối với giấy dầu, còn nếu dùng polyetylen thì có thể sử dụng một mỏ hàn nhiệt để dán lại. Bao cách ly phải có độ trong cần thiết và đủ dai khi gặp mƣa, nhanh khô khi bị ƣớt. Thẻ đánh dấu có thể đƣợc làm từ giấy dầu, cắt thành các dải rộng 4 – 5cm. Sau đó cắt dải giấy thành những đoạn từ 10 – 12 cm. Sử dụng những đoạn giấy này làm thẻ, mỗi thẻ đục một lỗ ở mép và luồn một sợi dây nhỏ hay chỉ khâu để buộc
lên cây.
b. Chọn cây bố mẹvà chuẩn bị cây lai
Sau khi đã xác định đƣợc tổ hợp lai, chọn đƣợc cặp bố mẹ cần trồng cây để có vật liệu lai. Thƣờng thì cây lai đƣợc trồng ở ruộng riêng, đƣợc chăm sóc chu đáo để chúng sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng. Cần nghiên cứu kỹ vật liệu lai đểbố trí sao cho
cây bố và cây mẹ nở hoa trùng khớp. Nếu cần có thể sử dụng các biện pháp đặc biệt để điều chỉnh bố mẹ ra hoa cùng nhau nhƣ xử lý ánh sáng, xử lý nhiệt độ thấp, dùng chất điều tiết sinh trƣởng… Chọn cây sinh trƣởng tốt, khỏe mạnh, điển hình, trồng ở ruộng kỹ thuật cao hoặc trồng trong chậu ở trong nhà kính để dễ chăm sóc và bảo quản. Để khử đực thụ phấn có hiệu quả cần nghiên cứu cấu tạo hoa, thời gian nở hoa, sức sống hạt phấn, cấu tạo nhụycái. Điều chỉnh thời gian nở hoa bằng cách gieo lệch ngày (giống ra hoa sớm gieo sau).
Chọn cây lai, cắt bỏ các cây không dùng cho phép lai, loại bỏ lá chết, lá vàng úa, cắt bỏ hoa thừa. Trong các cây đƣợc dùng để lai chọn những chùm hoa, những hoa ra sớmnhất, loại bỏ các hoa phát triển không đầy đủ (chƣa hoàn chỉnh) hay những hoa đã
tàn, chỉ để lại những hoa dùng cho lai. Ngoài ra còn bỏ tất cả các phần của cụm hoa và của hoa làm cản trở đến việc khử đực và thụ phấn. Ví dụ: Với lúa, ở cây mẹ chỉ cần giữ một số hoa nhất định 15 –20 hoa/bông, hoa không non, không già và có bao phấn mọc đến 2/3 vỏ trấu.
c. Khử đực và bao cách ly
Khử đực: Là việc tách tất cả các bao phấn ra khỏi hoa cây mẹ để phấn của nó không rơi vào đầu nhụy. Việc khử đực đƣợc thực hiện cả ở cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Đối với các cây có hoa đơn tính mà ở chúng hoa đực hoàn toàn riêng rẽ thì không
cần khử đực, công việc đơn giản là cắt bỏ hoa đực vào những lúc thích hợp (ví dụ ở ngô, bầu bí và ở các cây khác).
Các hoa ở cây mẹ phải đƣợc khử đực triệt để trƣớc khi nhị đực tung phấn. Đây là khâu quan trọng đặc biệt ở cây tự thụ phấn. Khi khử đực không đƣợc làm tổn thƣơng nhụy, không làm vỡ bao phấn và phải loạibỏ hết nhị. Thông thƣờng ở hầu hết các loài cây trồng đều tiến hành khử đực vào chiều hôm trƣớc và thụ phấn vào sáng hôm sau.
Tuy nhiên, cần nghiên cứu kỹ đặc tính nở hoa của từng loài cây để xác định thời điểm khử đực tốt nhất sao cho bộ phận đực bị tiêu diệt nhƣng bộ phận cái vẫn nguyên vẹn, sức sống bình thƣờng. Có rất nhiều phƣơng pháp khử đực khác nhau đƣợc xếp thành 3
nhóm: 1) Khử đực bằng tay: Những loại cây có hoa đủ lớn, dễ phân biệt các bộ phận của hoa (lúa, cà chua, đậu…) dùng panh gắp bỏ hết bao phấn ở hoa của cây mẹ, không làm tổn thƣơng đầu vòi nhụy; 2) Khử đực bằng máy: Dùng máy hút chân không có vòi
nhỏ để hút bỏ các bao phấn và 3) Khử đực bằng hóa chất: Áp dụng cho những cây có
hoa rất nhỏ, xử lý hóa chất vào thời kỳ phân hóa hoa để diệt giao tử đực mà không làm ảnh hƣởng đến giao tử cái. Các loại hóa chất thƣờng dùng là Hydrazid của axít malic, ester thơm.
Nhìn chung, khi khử đực thƣờng để lại bao hoa (vì nó đóng vai trò quan trọng trong việc nảy mầm của hạt phấn và sự lớn lên của ống phấn). Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp cần thiết khi khó tách các bao phấn ở những cây có hoa rất bé (ví dụ hoa đậu tƣơng) và với mục đích nâng cao hiệu suất lao động thì mới tiến hành khử đực đồng thời với việc tách cả bao hoa.
Sau khi khử đực, dùng thẻ ghi tên giống, ngƣời khử, ngày khử và cần bao cách ly để tránh sự xâm nhập của hạt phấn lạ. Đối với các cây có hoa đơn tính hoặc các dòng bất dục thì không cần khủ đực mà chỉ cần bao cách ly trƣớc khi hoa nở từ 12 –20 giờ. Vật liệu cách ly thƣờng dùng là túi giấy dầu hay polyetylen (kích thƣớc của bao tùy thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu), có độ trong cần thiết và đủ dai khi gặp mƣa, nhanh khô khi bị ƣớt (nhƣ trình bày ở mục a). Ở chỗ buộc bao dƣới lớp polyetylen hay giấy dầu cần lót một lớp bông mỏng để ngăn cản sự xâm nhập của côn trùng.
d. Thụ phấn
Thụ phấn là việc đƣa vào vòi nhụy hoa cây mẹ phấn của hoa cây bố (cây cho), đƣợc tiến hành sau khi khử đực một vài ngày tùy thuộc vào đối tƣợng và điều kiện thời tiết. Thời tiết lạnh, trời u ám và mƣa nhiều làm chậm trễ sự chín của nhụy và các bao phấn, còn thời tiết khô và nóng thúc đẩy quá trình này nhanh hơn. Việc thụ phấn phải tiến hành vào lúc nhụy hoa hoàn toàn chín và sẵn sàng tiếp nhận hạt phấn. Tuổi của hạt phấn thích hợp nhất cho việc thụ phấn và thời gian sống của nó đƣợc xác định theo khả năng tạo hạt của nhụy. Ở một số trƣờng hợp đặc biệt sẽtiến hành thụ phấn lặp lại (tức là đƣa hạt phấn lên nhụy liên tục một số ngày).
Hoa của cây bố có phấn đã chín đƣợc thu thập cho vào một hộp, sau đó đƣa hạt phấn lên đầu nhụy bằng bút lông mềm hoặc một dụng cụ khác nào đó. Thời điểm thụ phấn tốt nhất là buổi sáng vào lúc hoa nở tự nhiên (khoảng từ 7 – 10 giờ). Không thụ phấn cho hoa vào lúc mƣa hay những lúc quá nóng trong ngày. Sau khi thụ phấn ghi vào thẻ tổ hợp lai, ngƣời thụ phấn, ngày thụ phấn sau đó đeo thẻ lên cây mẹ. Nên lai với một số lƣợng nhất định để ở F1 có khoảng 100 cây lai, F2 có từ 500 – 1.000 cây. Số lƣợng hoa lai này bảo đảm tạo đƣợc nhiều dạng lai. Cây lai sau đó phải đƣợc theo dõi thƣờng xuyên để phòng chống dịch hại cây, quả và hạt lai. Bón đầy đủ dinh dƣỡng để cây sinh trƣởng phát triển tốt. Khi hạt lai chín phải thu hoạch kịp thời, ghi ngày thu hoạch, bảo quản hạt lai cẩn thận để sử dụng trong các giai đoạn tiếp theo.
5.1.2.2. Kỹ thuật lai ở ngô
Hạt ngô của các dạng bố mẹ đƣợc gieo với khoảng cách 60 × 70 × 30, sao cho cứ hai hàng cây mẹ thì có một hàng cây bố và sau đó cắm một bảng đánh dấu các dạng bố mẹ ở gần hàng ngô đã gieo. Đối với cây mẹ, khi cây mới nhú cờ thì cần loại bỏ ngay đi, không để cho bông cờ xòe ra và phơi màu. Lúc bắp mới nhú khỏi bẹ lá trƣớc khi phun râu thì phải dùng bao cách ly bao bắp lại.
Cờ ngô cũng đƣợc bao cách ly bằng giấy dầu hay giấy bóng mờ (polyetylen) vào
lúc bắt đầu nở hoa (tung phấn) và không muộn hơn 24 tiếngtrƣớc khi thụ phấn. Khi cây
mẹ phunrâu, tiến hành thu phấn từ cây bố, lấy phấn vào lúc 7 –8 giờ sáng. Nhẹ nhàng rung các phấn vào bao cách ly cờ, sau đó đem rắc lên các vòi nhụy (râu ngô).
Sau khi thụ phấn, dùng túi cách ly bao kín bắp lại, khi râu đã thâm hết thì bỏ bao cách ly đi. Mỗi bắp buộc một thẻ ghi công thức lai, ngày thụ phấn. Những hạt chín trên bắp ngô ở năm lai là thế hệ hạt lai F1. Trên chúng có thể quan sát đƣợc biểu hiện của
tính trạng trội. Năm sau gieo hạt F1, mọc thành cây F1, cho chúng tự thụ phấn bắt buộc sẽ thu đƣợc hạt lai F2. Tập trung các hạt F2 để phân tích sự di truyền của những tính trạng cần nghiên cứu.
5.1.2.3. Kỹ thuật lai ở đậu Hà Lan
Hạt đậu Hà Lan của các dạng bố mẹ đã chọn đƣợc gieo trong vƣờn thí nghiệm với
hàng cách hàng 50 – 60 cm, nếu gieo dày quá sẽ không thuận tiện cho việc tiến hành lai. Sau đó, các cây con cần đƣợc buộc vào giàn/giá đỡ cứng (có thể làm bằng tre hay nứa).
Hình 5.1. Lai hữu tínhở đậu Hà Lan
Nguồn: https://hoc24.vn/ly–thuyet/quy–luat–phan–li.147/
Ở giai đoạn ra nụ: Khi các nụ non còn có màu xanh nhạt thì tiến hành khử đực.
Nếu các hoa đã mọc thành 2 –3 chiếc một ở nách lá thì ởchúng đã xảy ra tự thụ phấn. Những nụ hoa quá non cũng không thích hợp với việc khử đực cần loại bỏ.
Thao tác tiến hành khử đực cho đậu Hà Lan nhƣ sau: Ngón tay trái giữ đài hoa, tay phải dùng panh tách cánh hoa để xuống dƣới. Sau đó vứt bỏ tất cả nhị. Các hoa đã
đƣợc khử đực của cây mẹ đƣợc thụ phấn bằng phấn của cây cho (cây bố). Việc thụ phấn cho đậu Hà Lan có thể tiến hành ngay sau khi khử đực. Nếu việc thụ phấn đƣợc tiến
hành 1 –2 ngày sau khi khử đực tức là lúc nhụy đã chín thì các hoa đã khử phải đƣợc phủ bao cách ly ngay.
Mang bao phấn của cây bố để cho hạt phấn tiếp xúc với đầu nhụy của hoa đã đƣợc khử đực, cũng có thể tập trung các hạt phấn của các cây bố vào đĩa petri rồi dùng bút lông mềm đƣa phấn vào đầu nhụy hoa mẹ. Các hoa đã đƣợc khử đực và thụ phấn cần đƣợc bao bằng bao cách ly ngay.
Vài ngày sau khi thụ phấn, khi hạt phấn bắt đầu hình thành cần bỏ bao cách ly. Những hạt trong quả đậu ở năm lai đã là thế hệ lai thứ nhất (F1), trên chúng có thể quan sát sự biểu hiện của tính trạng trội. Vụ sau/năm sau, gieo các hạt F1 mới thành cây F1,
trong quả của chúng do tự thụ phấn tạo nên hạt lai F2.Tập trung các hạt lai F2 để phân tích sự di truyềncủa những tính trạng cần nghiên cứu.