2.2.1. Các bƣớc làm tiêu bản nén tạm thời và quan sát các pha của quá trình nguyên phân
2.2.1.1. Vật liệu và thiết bị, hóa chất
–Rễ hành (Alliumcepa, 2n = 16) và một số cây trồng khác.
–Kính hiển vi quang học với vật kính ở độ phóng đại 10X và 40X.
– Lam kính (kính mang vật), lamen (kính đậy vật), kim mũi mác (kim tiêu bản), panh, dao lam, giấy thấm, đèn cồn…
Hóa chất: Dung dịch Carnoy biến đổi, cồn 70o, dung dịch thuốc nhuộm axeto cacmin (3%), nƣớc cất, axit axetic (45%).
2.2.1.2. Phương pháp cốđịnh mẫu
Quá trình phân bào nguyên nhiễm có thể đƣợc quan sát ở những tế bào thuộc vùng mô phân sinh nhƣ là chóp rễ non, chóp rễ mầm, đỉnh sinh trƣởng của cây. Phƣơng pháp cố định mẫu rễ hànhđƣợc thực hiện nhƣ sau:
– Rửa sạch củ hành và cắt hết rễ. Sau đó giâm trong môi trƣờng ẩm (nhƣ cát ẩm, đất + tro trấu hoặc nƣớc) từ 2–3 ngày hoặc cho đến khi rễ phát triển dài khoảng 0,5 – 1,5 cm (Hình 2.9), sau đó cắt thu lấy rễ và rửa sạch bằng nƣớc cất(thời điểm tốt nhất để lấy rễ là từ 7– 8 giờsáng, vì thời điểm này tế bào phân chia mạnh nhất).
–Ngay sau khi thu rễ phải cố địnhngay, tốt nhất là cố định ởnhiệt độ thấptrƣớc, tức là đặt cốc chứa mẫu trên khay đá lạnh, trong cốc không cần đựng dung dịch nào (có thể dùng đĩa petri để đựng mẫu). Sau đó cho một ít nƣớc cất vào cốc đựng mẫu và để trong ngăn đá của tủ lạnh khoảng 2–5 phút cho đến khi tạo váng. Lấy cốc đựng mẫu và để trong tủ lạnh ở ngăn mát khoảng 24giờ.
– Sau 24 giờđƣa mẫu ra nhiệt độ phòng, rửa sạch rễ bằng nƣớc cất và ngâm trong dung dịch Carnoy biến đổi trong 12 – 24 giờ. Việc này có tác dụng: Giết chết tế bào, ngăn chặn quá trình phân chia của tế bào, làm xơ cứng vách tế bào để cố định hình dạng khi quan sát.
–Sau đó mang rửa rễ bằng cồn 70 – 80%cho đến khi hết mùi chua của axit (Hình 2.10) và bảo quản mẫu ở nhiệt độ tủ lạnh khoảng 10 – 15oC. Mẫu rễ hành đƣợc cố định bằng phƣơng pháp này và tồn trữ trong điều kiện trên có thể sử dụng trong thời gian dài khoảng 1 –2 năm để quan sát các giai đoạn của quá trình nguyên phân.
– Khi làm tiêu bản để quan sát sẽ tiến hành nhuộm màu bằng dung dịch axeto cacmin (3%) với thể tích thuốc nhuộm ≥ 3 thể tích rễ hành. Đun hỗn hợp gồm thuốc nhuộm và rễ hành trên ngọn lửa đèn cồn từ 2– 3 phút.
Hình 2.10. Rễ hành đƣợc cố định trong dung dịch Carnoy biến đổivà rửa bằng cồn 70o
2.2.1.3. Phương pháp thực hiện tiêu bản tạm thời
Để quan sát quá trình phân bào nguyên nhiễmở tế bào chóp rễ hành (Hình 2.11.), các bƣớc thực hiện một tiêu bản tạm thời nhƣ sau (Hình 2.12):
Hình 2.11. Cấu tạo rễ hành
1 – Gắp 1 rễ hành cho lên lam kính
2 – Cắt phần chóp rễ (phần bắt màu đậm hơn)
3 – Nhỏ 1–2 giọt axit axetic 45%
4 – Đậy mẫu bằng lamen và tán đều mẫu
– Dùng panh nhọn để gắp 1 – 2 rễ hành đã đƣợc cố định đặt lên lam kính, tiếp theo dùng kim mũi mác hay dao lam cắt phần chóp rễ với chiều dài khoảng 0,5 – 1 mm. – Nhỏ 1– 2 giọt axit axetic (45%) lên các chóp rễ, bảo đảm che phủ toàn bộ các chóp rễ và ngâm trong 1 –2 phút. Mục đích của thao tác này làm nhạt bớt màu của tế bào chấtvà làm mủn mẫu vật.
– Dùng kim mũi mác ấn nhẹ chóp rễ cho rễ dập ra đểcác tế bào dàn mỏng và tách rời nhau.
–Nhỏ 1–2 giọt thuốc nhuộm axeto cacmin vào mẫu rễ và nhuộm trong 1– 2 phút. – Đậy mẫu lại bằng lamen sao cho góc tạo giữa lam kính và lamen bằng 45o. Dùng cán kim mũi mác tán mẫu cho các tế bào phân tán đều ra.
Sau khi tán mẫu, tiêu bản thu đƣợc có thể sử dụng để quan sát ngay.
2.2.1.4. Yêu cầu đối với sinh viên
–Hãy cho biết tại sao nói nguyên phân là cơ sở của sự sinh sản vô tính? Ý nghĩa di truyền học của sự phân bào nguyên phân?
–Thực hiện một vài tiêu bản nén tạm thời để quan sát các giai đoạn của quá trình nguyên phân ở tế bào chóp rễ hành.
– Quan sát tế bào tiêu bản chóp rễ hành dƣới kính hiển vi để nhận biết và phân biệt các kỳtrong quá trình nguyên phân của tế bào chóp rễ hành qua sự thay đổi trạng thái cũng nhƣ vị trí của nhiễm sắc thể. Chú ý các biểu hiện khác nhau của tế bào ở từng giai đoạn phân bào.
–Vẽ và chú thích các kỳcủa quá trình nguyên phân ở tế bào chóp rễ hành. –Đếm số lƣợng tế bào ở các kỳcủa nguyên phân và viếtvào bảng sau:
Số lần đếm Số lượng tế bào Tổng số
Kỳ trung gian (I) Kỳ đầu (P) Kỳ giữa (M) Kỳ sau (A) Kỳ cuối (T) 1
2 3 Trung bình
Từ đó xác định chỉ số phân bào?
2.2.2. Quan sát hình thái và đếm sốlƣợng nhiễm sắc thể
2.2.2.1.Vật liệu và thiết bị
Để quan sát hình thái và đếm số lƣợng nhiễm cần chuẩn bị các vật liệu và thiết bị nhƣ sau:
–Các bao phấn non, rễ non, lá non của hành tây, dƣa chuột, đậu Hà Lan đã đƣợc cố định (Carnoy và giữ trong cồn 70% đến 80% (xem mục 6 bài 1).
– Kính hiển vi có độ phóng đại lớn 600 –1000 lần hoặc kính hiển vi ba mắt B– 353PLi/có gắn camera (xem phụ lục 4) hoặc gƣơng vẽ và mạng lƣới thị kính.
– Dao lam, giấy thấm, kim tiêu bản, đèn cồn, lam kính và lamen sạch. –Hóa chất: Axeto cacmin 3% (hoặc lacmoit), axit axetic 45%.
2.2.2.2. Phương pháp tiến hành
a. Trên bao phấn non của hành tây
–Các bƣớc làm tiêu bản:
+ Dùng kim tiêu bản tách 2 –3 bao phấn ở các vị trí khác nhau của hoa. Loại bỏ các cơquan phụ của hoa giữ lại các bao phấn trên lam kính.
+ Giầm nát các bao phấn bằng kim tiêu bản. Nhỏ 1 – 2 giọt axeto cacmin 3% (hoặc lacmoit) rồi tiếp tục giầm nát. Đun sôi nhỏ lửa trên ngọn đèn cồn vài lần. Thời gian nhuộm 7– 10 phút.
+ Dùng giấy thấm hút hết axeto cacmin còn thừa, nhỏ một giọt axit axetic 45% hoặc glicerin rồi đậy lamen (chú ý tránh bọt khí), đặt một tờ giấy thấm lên lam kính, dùng đầu que diêm không thuốc gõ nhẹ dể dàn mỏng tế bào trên tiêu bản thành một lớp.
–Yêu cầu đối với sinh viên:
+ Mỗi sinh viên cần chuẩn bị 10 tiêu bản có các đĩa kỳgiữa.
+ Lần lƣợt quan sát các tiêu bản đã chuẩn bị trên kính hiển vi có độ phóng đại từ 600 – 1000 lần. Phát hiện các tiêu bản có các đĩa kỳgiữa rõ.
+ Sử dụng máy ảnh để chụp (xem phụ lục 4) hoặc gƣơng vẽ trên kính hiển vi, dùng bút chì vẽ lại chi tiết bộ nhiễm sắc thể quan sát đƣợc ở các tế bào (xem phụ lục 3).
+ Qua trắc vi vật kính và trắc vi thị kính xác định mức độ phóng đại củabộ nhiễm sắc thể (xem phụ lục 2).
+ Đo kích thƣớc của mỗi nhiễm sắc thể đơn giản ở giai đoạn kì giữa để nhận dạng nhiễm sắc thể về chiều dài tƣơng đối, chỉ số vai, chỉ số tâm động. Qua đó phân loại các kiểu nhiễm sắc thể và cho biết số lƣợng bộ nhiễm sắc thể đơn bội.
b. Trên lá non củ cải, đậu, cà chua
–Các bƣớc làm tiêu bản:
+ Cố định các lá non, củ cải, đậu, cà chua, vv…(lúc rễ có độ dài 3– 7 mm) trong dung dịch carnoy 1giờ 30 phút –4 giờ.
+ Chuyển các lá non đã cố định vàohỗn hợp HCl đậm đặc và cồn metylic theo tỉ lệ 1:1, giữ chúng trong hỗn hợp đó 5 phút.
+ Dùng panh nhỏ chuyển 1 lánon lên lam kính, nhỏ 1 giọt axeto cacmin 3% lên lá non, hơ nhẹ vài lần trên ngọn lửa đèn cồn.
+ Đậy lamen, dùng giấy hút hết axeto cacmin thừa. Giỏ vào 1 góc lamen 1 giọt axit axetic 45% và dàn mỏng tiêu bản.
–Yêu cầu đối với sinh viên:
+ Mỗi sinh viên chuẩn bị xong 10 tiêu bản.
+ Đƣa các tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi có độ phóng đại lớn.
+ Phát hiện các đĩa kì giữa, rồi tiến hành xác định các chỉ tiêu nhƣ phần thu nhận kết quả trên rễ đậu Hà Lan, dƣa chuột, hành tây.
c. Trên rễ đậu Hà Lan, dưa chuột, hành tây
–Các bƣớc làm tiêu bản:
+ Chuẩn bị và cố định mẫu: Gieo các loại hạt trên vào cát ẩm sau khi rễ dài từ 1– 1,5 cm cắt lấy phần rễ, rửa sạch bằng nƣớc lạnh và cố định chúng trong dung dịch carnoy. Đối với hạt hành tây thì có thể cố định luôn cả hạt và rễ. Thời gian cố định 3 giờ. Cố định xong chuyển giữchúng trong cồn 70% hoặc 80%.
+ Nhuộm mẫu vật: Cắt lấy phần chóp rễ non đã cố định của mỗi loài cây trên (phần mô phân sinh) đặt lên lam kính sạch, nhỏ 1 giọt axeto cacmin 3%, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn vài lần. Thời gian nhuộm 7 –10 phút. Dùng giấy thấm hút hết axeto cacmin còn thừa; sau đó nhỏ 1 giọt axit axetic 45%, đậy lamen lên và dàn mẫu vật thật mỏng nhƣ trên.
–Yêu cầu đối với sinh viên:
+ Mỗi sinh viên chuẩn bị xong 10 tiêu bản.
+ Sau đó lần lƣợt đƣa các tiêu bản quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại lớn phát hiện các đĩa kỳ giữa tốt.
+ Sử dụng máy ảnh để chụp hoặc gƣơng vẽ, trắc vi vật kính, trắc vi thị kính tiến hành vẽ, đo đếm số lƣợng nhiễm sắc thể của từng loài cây nghiên cứu vào vở tƣờng trình rồi ghi nhận xét.
Bài 3.PHƢƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN PHẤN HOA, NGHIÊN CỨU CÁC PHA CỦA GIẢM PHÂN
VÀ ĐÔINHIỄM SẮC THỂ TIẾP HỢP
Mục đích giúp người họchiểu rõ những kiến thức cơ bản về cơ chế và ý nghĩa di
truyền học của quá trình giảm phân. Phân biệt được sự khác nhau giữa quá trình
nguyên phân và quá trình giảm phân. Hiểu rõ phương pháp chuẩn bị tiêu bản và thực
hiện được tiêu bản nén tạm thời trên phấn hoa để quan sát quá trình giảm phân ở thực vật. Quan sát và nhận biết dưới kính hiển vi quang học các kỳcủa quá trình giảm phân ở cây ngô thông qua sự biến đổi về hình thái cũng như vị trí của nhiễm sắc thể.
3.1. GIẢM PHÂN (PHÂN CHIA GIẢM NHIỄM) 3.1.1. Các dạng giảm phân ở sinh vật