7.2.1. Đối với cây sinh sản hữu tính (sinh sản bằng hạt)
7.2.1.1. Chuẩn bị vật liệu
Vềnguyên tắc, vật liệu đƣợc chọn nên là những giống tốt nhất, thích nghi với điều kiện địa phƣơng và có ít nhất các tính trạng cần phải cải tiến. Vật liệu càng tốt bao nhiêu thì ở chúng càng tích lũynhiều gen trội bấy nhiêu và càng có khả năng cho nhiều dạng đột biến có giá trị. Cũng có thể dùng các dạng con lai F1. Ƣu điểm của việc sử dụng con lai F1 là cả hai genom khác nhau khi đồng thời chịu tác động của tác nhân đột biến thì khả năng tái tổ hợp gen sẽtăng lên và phổ đột biến sẽ rộng hơn. Đối với hạt lai, phải dùng nồng độ và liều lƣợng đột biến thấp hơn khoảng 2 lần so với mức bình
thƣờng.Đối với cây sinh sản bằng hạt thì việc dùng các tác nhân vật lý hay hoá học đều tiệnlợi và thích hợp. Tuy nhiên, hạt là một tổ chức đa bào mà đột biến thì chỉ xảy ra ở mộthay một số tếbào nào đó, nên thƣờng có hiện tƣợng khảm xảy ra ở cây F1.
Các dạng vật liệu ban đầu nên phong phú để có khả năng làm tăng tính đa dạng
của biến dị xuất hiện ở M2. Thời gian sau lúc xử lý và gieo không nên cách xa nhau để tránh việc làm tăng hiệu quả huỷ hoại của các tác nhân đột biến.
7.2.1.2. Chọn tác nhân đột biến và liều lượng/nồng độ
Việc lựa chọn tác nhân đột biếnkhông đơn thuần chỉ là dựa trên tần số gây ra các kiểu đột biến mong muốn của tác nhân đó, mà còn phải xem xét đến vật liệu cần đƣợc xử lý.
Tần số và phổ đột biến ít nhiều phụ thuộc vào loại hình và liều lƣợng của tác nhân đột biến. Các tác nhân vật lý nhƣ tia X và gamma đƣợc sử dụng rất rộng rãi, chúng có ƣu điểm về khả năng xuyên thấu và việc tính liều lƣợng chính xác. Các tác nhân hoá học thƣờng đƣợc coi là các tác nhân có khả năng gây ra các đột biến gen với
tần số cao, nhƣng có đặc điểm là tính thẩm thấu không đƣợc xác định chính xác cho từng loại đối tƣợng, tính không ổn định, sự biến chất và cuối cùng là tính không an toàn trong sử dụng.
Tùy thuộc vào từng loại đối tƣợng cây trồng và mục đích nghiên cứu mà lựa chọn loại hình cũng nhƣ liều lƣợng, nồngđộ cho phù hợp (xem bảng 7.1 và 7.2).
7.2.1.3. Theo dõi và chọn lọc đột biếnở các thế hệ
Việc phát hiện một cách có hiệu quả các đột biến mong muốn với chi phí thấp là
điều quan trọng và phụ thuộc vào vào quy mô xử lý đột biến cũng nhƣ phƣơng pháp
chọn giống đƣợc áp dụng. Điều chú ý là, khối lƣợng công việc sẽ tăng lên hay giảm đi một cách rất đáng kể, tuỳ thuộc vào phƣơng pháp thu hoạch ở M1 và gieo trồng ở M2: Thu tất cả các hạt ở M1 hoặc mỗi cây thu 1 hạt hoặc thu mỗi cây 1 bông hay một số
bông (hay quả). Nhƣ vậy, ở M2 sẽ phải gieo hạt của 1 cây thành 1 dòng (hàng) hay hạt của 1 bông thành 1 dòng.
Dƣới đây trình bày các nội dung nghiên cứu ở các thế hệ khác nhau:
a. Nghiên cứu thế hệ thứ nhất (M1)
–Số lượng cá thể và kĩ thuật gieo trồng: Số lƣợng cây của mỗi lô thí nghiệm ở M1
phụ thuộc vào số lƣợng hạt, cây hoặc bộ phận của cây mang xử lí và liều lƣợng nồng độ củatác nhân sử dụng.
Ở M1 phải gieo một lƣợng hạt để đảm bảo cho việc thu đƣợc từ 250 – 500 cây ra hoa, kết hạt đối với mỗi liều lƣợng hay nồng độ (tức là để có một số lƣợng dòng ở M2 là
từ 250 –500). Muốn vậy phải gieo 700–1500 hạt trong mỗi công thức thí nghiệm. Nếu mụcđích chỉ nhằm thu những đột biến theo một số tính trạng nhất định thì số hạt phải tăng lên. Riêng thí nghiệm với mục đích chọn giống thì cuối M1 còn 500 – 1000 cây/lô.
Sự gieo trồng ở M1 áp dụng các biện pháp thông thƣờng trong chọn giống theo
đối tƣợng cây nghiên cứu.Đối với đậu nên gieo cây vừa phải, còn đối với lúa nên gieo
dầy để khống chế đẻ nhánh. Nên gieo từng hạt để tiện quan sát các biến dị xuất hiện.
–Những chỉ tiêu cần nghiên cứu ở M1:
+ Tỉ lệ sống sót từ khi gieo đến khi thu hoạch.
+ Mức độ xuất hiện các thể khảm.
+ Tần số biến dị hình thái: Thân, lá, bông/quả, hạt.
Tác dụng hủy hoại của tác nhân phóng xạvà hóa họcthể hiện ở tần số và phổ đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể ở giảm phân lần đầu ở tế bào chóp rễ hoặc ở giảm phân trong tế bào mẹ hạt phấn, độ hữu dục hạt phấn hoặc hạt, các dạng kìm hãm không có khả năngtrổbông, kết hạt, v.v…
Những biểu hiện về sinh trƣởng của cây ở M1 thƣờng là: Sinh trƣởng chậm, phân nhánh ít, bề mặt tán cây nhỏ đi... hoặc trởnên dị dạng, mầm chồi chết sớm. Cũng có khi
Một điều cần đặc biệt lƣu ý là các đột biến ở M1thƣờng là những đột biến lặn nên kiểu hình của nó giống với dạng ban đầu, rất khó phát hiện. Bởi vậy, việc chọn lọc các cây có biến dị ở M1 là rất khó. Tuy nhiên, không có nghĩa là không cần tiếnhành chọn lọc ở M1, vì nhiều trƣờng hợp ở M1 có thể tìm đƣợc những dạng đột biến có nhiều giá
trị kinh tế cao.
Các thí nghiệm ở M1phải đƣợc lặp lại 2– 3 lần, nếu mục đích chỉ là thu đột biến thì không cần lặp lại.
b. Nghiên cứu thếhệ thứ hai (M2)
Gieo thế hệ thứ2 nhằm những mục đích sau: 1) Phát hiện và phân lập các đột biến lặn;
2) Chọn lọc những cây phát triển tốt hoặc bình thƣờng để từ đótách ra những đột biến mớitrong các thế hệ sau;
Vấn đề đƣợc đặt ra là, từ M1chọn những cây nhƣ thế nào và chọn bao nhiêu hạt để gieoở M2. Về nguyên tắc thì phải lấy tất cả các cây ở M1để gieo ở M2, không phân
biệt cây cóbiến dị hay không. Nhƣng các cây có biến dị nên gieo riêng. Tuy nhiên, làm
nhƣ vậy khốilƣợng công việc ở M2 sẽ tăng lên rất nhiều. Nhƣng đến nay vẫn chƣa có những kết quảđáng tin cậy nào về việc chọn những cây nhƣ thế nào ở M1để sang M2
cho ra nhiều độtbiến nhất.
Việc chọn hạt ở M1tùy thuộc vào phƣơng pháp gieo chúng ở M2, có hai phƣơng
pháp gieo đƣợc đƣa ra:
– Gieo cây thành dòng (một cây –một dòng):
Ở M1 phải thu riêng hạt của từng cây rồi gieo riêng để tạo thànhmột dòngở M2 Phƣơng pháp này tỉ mỉ, tốn nhân công và vật tƣ nhƣng dễ phát hiện các dạng đột biến hơn, đặc biệt đối với các đột biến nhỏ. Mỗi cây ít nhất gieo 30 hạt.
–Gieo hỗn hợp:
Hạt ở M1 thu chung theo từng công thức (nồng độ, liều lƣợng). Từ lƣợng hạt chung ấy,lấy ra một khối lƣợng hạt nhất định phù hợp vớisố cây cần thiết nghiên cứu ở
M2 (mỗi cây ít nhất lấy 30 hạt). Phƣơng pháp này đỡ tốn nhân công nhƣng khó phát hiện các đột biến nhỏ.
Sốhạt đƣợc chọn ở M1để cho ra phải lớn hơn số hạt đãgieo để tạo M1. Điều cần chú ý là gieo hạt của cây M1 để thu M2 phải đảm bảo cách ly thật tốt, nhất là các cây
giao phấn.
Việc theo dõi, phát hiện đột biếnở thế hệ M2cũng tƣơng đối khó. Vì cây ở M2về
mặt hình thái cũng không khác lắm so với dạng ban đầu. Số cây có kiểu hình đột biến chỉ chiếm vài phần trăm và chỉcó thểnhận ra chúng qua một số đặc tính riêng lẻ (vì nó
thƣờng là lặn nên kiểu hình thể hiện không rõ ràng).
– Nếu mục đích là so sánh tác dụng của các tác nhân gây đột biến khác nhau và khảnăng cho đột biến của các thứ cây khác nhau thì phải tính tất cả các đột biến xuất hiện trong quá trình sống của cây. Chú ý, phải theo dõi qua các pha sinh trƣởng, vì các kiểu đột biến nhất định chỉ xuất hiện vào những pha nhất định.
– Nếu mục đích là thu thập các biến dị của một tính trạng nhất định thì sẽ tiến
hành chọn lọc theo một chế độ đặc biệt. Ví dụ ở họ hoà thảo, nếu nhằm tìm hiểu đột biến có tính chống đổ thì phải gieo trồng chúng trong điều kiện ẩm độ cao và chế độ
canh tác cao.
Nghiên cứu cây đối chứng và cây đột biến:
Nghiên cứu so sánh phải tiến hành thƣờng xuyên, từ khi gieo đến kỳ thu hoạch. Phân tích, so sánh trên nhiều chỉ tiêu sẽ phát hiện đƣợc những biến đổi quan trọng về
hình thái –giải phẫu, sinh lý, sinh hóa… Nhiều cây không còn nguyên vẹn mà bị thay đổi về tính trạng này hay tính trạng khác, hình dáng, màu sắc, kích thƣớc của rễ, thân, lá, hoa, quả, bông, hạt v.v…
Đột biến về thời gian sinh trƣởng có tần số khá cao.Những tính trạng quan trọng đối với trồng trọt nhƣ chín sớm, các yếu tố cấu thành năng suất, chống đổ, chống các điều kiện bất lợi, khả năng quang hợp cao, hàm lƣợng protein, đƣờng, vitamin, tinh dầu tăng v.v…cần đƣợc lƣu ý.
Kiểm tra di truyền các biến dị xuất hiện ở M1: Những biến dị xuất hiện ở M1, sang M2không di truyền đƣợc là những thƣờng biến. Nếu biến dị xuất hiện ở M1là đột biến trội thì sang M2sẽ phân ly.
Phát hiện và tính tần số đột biến:
Ởthế hệthứ hai phảitiến hành việc tính tần sốđột biến và xác định phổ đột biến.
Tính tần sốđột biến ở M2theo những phƣơng pháp sau:
1) Tính phần trăm cây có đột biến. Tức là tính số lƣợng tất cả các cây có đột biến ở M2trong mỗi công thức (mỗi liều lƣợng) rồi quy ra phần trăm (theo tổng số cây ở mỗi công thức). Ví dụ, trong một công thức có 1000 cây mà có 78 cây đột biến, thì phần trăm cây có đột biến là 7,8%. Phƣơng pháp tính này dùng cho trƣờng hợp khi gieo ở M2 không phải theo họ mà là gieo theo công thức hay thứ (gieo hỗn hợp).
2) Tính phần trăm dòng có đột biến. Ví dụ, trong tất cả các công thức có 500
dòng, số cây có đột biến đƣợc tìm thấy trong 60 dòng, thì % số lƣợng dòng có đột biến là 12%.
3) Sốlƣợng đột biến trong 100 dòng. Ví dụ, trong tất cả 500 dòng có 40 cây mang
mộtkiểu đột biến, 20 cây mang 2 kiểu đột biến, 10 cây mang 3 kiểu đột biến và 15 cây mang 4 kiểu đột biến, thì sốtrƣờng hợp có đột biến ở tất cả 80 họ trên là:
[(40 × 1) + (20 × 2) + (10 × 3) + (15 × 4)]
Để có khái niệm về tần số đột biến xuất hiện trong một điều kiện nào đó, không chỉ cần biết tần số đột biến trong một thí nghiệm mà cần tính đến giới hạn biến đổi ngẫu nhiên.
Vì vậy, cần phải xác định sai lệch phần trăm theo công thức:
m% = ± f% (100−f%)
𝑛
Ở đây, m% – sai lệch phần trăm; f% – tần số đột biến trong thí nghiệm; n – số cá thể hoặc số dòng có trong thí nghiệm.
Ví dụ: Phát hiện thể đột biến diệp lục trong lô có tổng số 625 cây. Trong trƣờng hợp này, tần số đột biến:
f% = ± 28 x 100
625 = 4,48% m% = ± 4,48(100− 4,48)
625 = ± 1,28%
Điều đó cho thấy trong những điều kiện thí nghiệm tƣơng tự, tần số đột biến diệp lục không nhất thiết là 4,48% mà có thể dao động ngẫu nhiên trong những giới hạn 4,48 ± 2×1,28%, nghĩa là từ 1,92% đến 7,04%. Kết quả này đúng với 95 trong tổngsố 100 trƣờng hợp, nghĩa là chỉ có 5 trƣờng hợp tần số đột biến nhỏ hơn 1,92% và lớn hơn 7,04%.
Kết quả xác định tần số đột biến gần với thực tế nhiều hay ít phụ thuộc vào chủ quan ngƣời quan sát,phƣơng pháp áp dụng và điều kiện tiến hành thực nghiệm. Muốn phát hiện những đột biến sinh lí quan trọng nhƣ chịu rét, chịu hạn, chịu mặn, chịu đƣợc các điều kiện bất lợi,chịu bệnh hại,v.v... cần gieo trên môi trƣờng có tác nhân đó. Ở M2 và M3, số đột biến lặn xuất hiện với tần số khá cao, đặc biệt là các dạng đột biến diệp lục.
c. Nghiên cứu thế hệ thứ ba (M3)
Ở thế hệ này cần kiểm tra di truyền những đột biến xuất hiện ở M2, phát hiện những đột biến mới xuất hiện (đặc biệt đối với các tính trạng xác định bởi gen đa hiệu).
Mặt khác,không loại trừ khả năngmột số đột biến lặn nhỏ sót lại từ M2; một số đột biến
lặn mới xuất hiện.
Để có M3, từ hạt các cây đột biến ở M2gieo riêng thành từng hàng.Nên chọn 1 – 3% số dòng không có biến đổi ở M2 mang gieo M3. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm tƣơng tự nhƣ M2. Ngoài ra, ngay từthế hệ M3, cần lƣu tâm đến những dòng có khả năng cho năng suất cao để nếu có thể,nhân trực tiếp thành giống đơn hệ hoặc dùng trong lai tạo giống.
Để phát hiện những đột biến nhỏ, ít có sai khác về hình thái so với dạng gốc nhƣng có nhiều biến đổi về sinh lý, sinh hóa và có giá trị kinh tế,áp dụng phƣơng pháp nhƣ sau:
Từ mỗi dòng M3chọn lấy một cây mọc tốt cho hiệu quả,lấy hạt mang gieo thành
1 – 2 hàng ở M3. Đối với những đột biến lớn, ở M3 nên gieo thành hàng và cứ 10– 15
hàng lại có một hàng trồng dạng gốc.Đối với đột biến nhỏ,cứ 5–10 hàng lại gieo một hàng đối chứng.
Ở M3, những đột biến thực sự giống nhau trong một lô có thể thu hoạch chung, hạt mang gieo nhiều hay ít để nhận M4tùy thuộc mục đích thí nghiệm.
d. Nghiên cứu thế hệ thứ tư (M4)
Tiếp tục khảo nghiệm những dạng tốt nhất tách ra từ M3. Những đột biến có lợi ở
M3 đƣợc gieo thành 2– 3 hàng để nhận M4. Khảo nghiệm các dòng đột biến theo các chỉ tiêu đánh giá vật liệu chọn giống.Loại bỏ những đột biến có hại.
e. Nghiên cứu thế hệ thứ năm (M5) và các thế hệ tiếp theo
Từ thế hệ thứ năm trở đi, công việc chủ yếu là khảo nghiệm và đánh giá các dạng đƣợc tách ra. Gieo những đột biến có lợi thành những ô rộng từ 5 – 15 m2, xác định năng suất và những tính trạng có ý nghĩa kinhtế.
Hiện nay, đối với cây tự thụ phấn (lúa, đậu tƣơng…), áp dụng quy trình nói trên
để phân tích di truyền và ứng dụng trong chọn giống.
Với mục đích chọn giống đơn thuần, có thể áp dụng một trong ba quy trình đơn giản sau đây để theo dõi nguyên liệu sau khi xử lý:
Quy trình I: Thu hoạch riêng hạt của từng cây M1và gieo riêng để nhận M2. Dòng
tốt nhất đƣợc thử nghiệm so sánh sơ bộ với nhau và với đối chứng và từ đó có thể thu
đƣợc dòng đột biến tốt nhất và nhân trong sản xuất.
Quy trình II: Gieo chung các hạt M1 để nhận các thế hệ M2. Từ quần thể M2 tiến hành chọn lọc cá thể đối với các đột biến có ý nghĩa kinh tế.
Quy trình III: Đƣợc áp dụng để phát hiện và chọn những thể đột biến có những tính trạng hoặc đặc tính đặc biệt nhƣ chống bệnh tốt, chín sớm, hạt mọc xít trên bông v.v...
Để đạt mục đích này, thƣờng sử dụng phƣơng pháp quần thể phối hợp với chọn lọc cá thể mong muốn.Những dạng này có thể đƣợc nhân lên hoặc đem lai giữa chúng với nhau hoặc với các dạng khác.
7.2.2. Đối với cây sinh sản vô tính
Những cây sinh sản vô tính thƣờng ở trạng thái dị hợp tử, nên việc lai hoặc tựthụ phấn thƣờng dẫn đến sự phân ly mạnh mẽ và làm mất đi những tính trạng tốt ban đầu của giống. Vì thế, chúng là vật liệu thích hợp cho chọn giống đột biến nhằm tạo ra sự thay đổiởmột vài tính trạng nào đó. Vật liệu thích hợp trong trƣờng hợp này là những