Cơ thể của hầu hết các loài sinh vật là đa bào đƣợc hình thành từ nhiều tế bào. Các tế bào trong cơ thể đều có những đặc điểm cơ bản giống nhau nhƣ: Màng sinh chất, tế bào chất, các bào quan, ty thể, lƣới nội chất, trung thể hay còn gọi là bộ máy phân bào. Khi mới hình thành cơ thể chỉ là một tế bào, cơ thể lớn lên chủ yếu do tăng số lƣợng tế bào chứ không phải do tăng khối lƣợng hay kích thƣớc của tế bào. Số lƣợng tế bào tăng lên nhờ quá trình nguyên phân (phân chia nguyên nhiễm) sau mỗi chu kỳ tế bào (vòng đời của tế bào).
Một chu kỳ tế bào bắt đầu từ cuối lần phân bào trƣớc đến cuối lần phân bào kế tiếp. Nói cách khác chu kỳ tế bào là khoảng thời gian giữa hai lần phân bào liên tiếp của tế bào. Nó gồm 2 giai đoạn chính: Giai đoạn chuẩn bị hay còn gọi là kỳ trung gian (hoặc tĩnh kỳ/ Interphase) và giai đoạn phân chia (Mitosis – M).
2.1.1. Giai đoạn chuẩn bị (kỳ trung gian)
Ở kỳ trung gian, tế bào tăng trƣởng và chuẩn bị cho sự phân bào, đặc biệt có sự tổng hợp ADN. Trong suốt giai đoạn này, không quan sát đƣợc nhiễm sắc thể vì đang ở dạng duỗi xoắn. Kỳ trung gian đƣợc phân thành ba giai đoạn nhỏ hay còn gọi là ba pha (Hình 2.1).
a. Giai đoạntrước tổng hợp ADN (G1)
Bắt đầu sau khi kết thúc lần phân chia trƣớc. Trong giai đoạn này, tế bào tăng trƣởng về kích thƣớc, tích tụ các chất liệu nhƣ các enzym và cơ chất cần thiết cho sự tổng hợp ADN. Nhiễm sắc thể ở trạng thái đơn(trạng thái một sợi), dạng sợi mảnh, các gen trên đó thực hiện chức năng nhƣ sao mã, tổng hợp protein và hình thành các loại ARN…Tốc độ chuyển hóa của tế bào trong giai đoạn này rất cao, tế bào chuẩn bị cơ sở vật chấtđể bƣớc vào tổng hợp ADN.
b. Giai đoạntổng hợp ADN (S)
Tế bào thực hiện quá trình tổng hợp ADN (ADN tự nhân đôi), tổng hợp các protein ở nhân nhƣ các protein histon và phi histon phục vụ cho sự kiến tạo sợi nhiễm sắc. Các nhiễm sắc thể bắt đầu tự nhân đôi để bƣớc vào kỳ phân chia.
Ngoài ra trong pha này còn diễn ra các quá trình tổng hợp nhiều hợp chất cao phân tử (các loại protein, ARN khác…) và các hợp chất giàu năng lƣợng (ATP và các hợp chất có liên kết cao năng khác).Đặc biệt là sự tự nhân đôi của trung tử (trung thể) có vai trò quan trọng trong hình thành thoi vô sắc sau này. Cuối giai đoạn này, mỗi nhiễm sắc thể ởtrạng thái képvới hai nhiễm sắc tửdính nhau ở tâm động.
c. Giai đoạnsau tổng hợp ADN (G2)
Trong giai đoạn này nhiễm sắc thể ở trạng thái sợi kép, tế bào thực hiện sự tích luỹ năng lƣợng, chuẩn bị các cơ sở vật chất khác để bƣớc vào giai đoạn phân chia. Trạng thái chuyển hóa của tế bào cũng gia tăng.
Ở ba giai đoạn trên thì giai đoạn G1 và G2 chiếm thời gian dài hơn vì đó là giai đoạntích lũy.Trong chu kỳ tế bào có 2 ngƣỡng mà tế bàomẫn cảm với nhiều tác động khác nhau:
– Ngƣỡng chuyển từ G1–S –nhiều tác động kích thích ngƣỡng này nhƣ tác động của các hoocmon sinh trƣởng, điều kiệndinh dƣỡng…
– Ngƣỡng chuyển từ G2–M – ngƣỡng này khá mẫn cảm với tác động kích thích của dạng phytohoocmon nhƣ xitokinin (Cytokinin).
2.1.2. Diễn biếncủa phân chia nguyên nhiễm
Phân chia nguyên nhiễm hay nguyên phân đã đƣợc Walter Flemming quan sát năm 1789, sau đó Strasburger mô tả tỷ mỉ và đặt tên cho các giai đoạn phân chia vào năm 1884.
Nguyên phân là quá trình phân chia chuyên biệt của tế bào, kết quả từ một tế bào mẹ ban đầu tạo thành hai tế bào con giống hệt nhau và giống hệt tế bào mẹ về mặt di
truyền. Nguyên phân xảy ra hầu hết ở các tế bào nhân chuẩnnhƣng khác cơ chế ở một số loài. Ở động vật nhân sơ, tế bào không có nhân hay nhân không hoàn chỉnh thì quá trình phân chia diễn ra theo lối trực phân (hiện tƣợng phân chia nhân không thấy xuất hiện thoi phân chia và dẫn đến tạo thành các nhân con với bộ nhiễm sắc thể không đều nhau. Thƣờng gặp trong tế bào của những mô chuyên hoácao và trong tế bào các mô có tính tạm thời (noãn tâm, nội nhũ, ngoại nhũ, nhu mô và cácmô khác) và cả trong tế bào bị biến đổi do bệnh lí).
Nguyên phân xảy ra ở các tế bào sinh dƣỡng, nhất là các tế bào ở vùng mô phân sinh nhƣ:
–Mô phân sinh đỉnh (chồi ngọn, chóp rễ…).
–Mô phân sinh bên (ở thân cây, giúp cây phát triển bề ngang). – Mô lóng (ở cây họ lúa: Lúa, ngô, mía,…).
– Mô sẹo (giúp cây làm lành các vết thƣơng).
Quá trình nguyên phân gồm 4 kỳ: Kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối (Hình 2.2 và Hình 2.3).
Đầu kỳ đầu Cuối kỳ đầu
Kỳ giữa Kỳ sau Kỳ cuối
Hình 2.2. Mô hình mô phỏng quá trình nguyên phân
a. Kỳ đầu (Prophase)
Đây là pha dài nhất của phân chia nguyên nhiễm. Vào đầu kỳ đầu các nhiễm sắc thể ở dạng sợi mảnh nằm rải rác trong nhân bắt đầu co xoắn và hiện rõ dần. Lúc này
nhân có thể tích tăng hơn, màng nhân và nhân con (tiểu hạch) vẫn còn quan sát đƣợc. Cuối kỳ đầu nhiễm sắc thể tiếp tục co xoắn và lớn hơn về bề rộng. Màng nhân và nhân con tiêu biến. Trung tử tách nhau ra và tiến về hai cực của tế bào, giữa chúng hình thành sợi tơ vô sắc (thoi vô sắc). Sợi tơ vô sắc đƣợc cấu tạo từ các protein có cấu trúc tựa các sợi cơ, chúng đi theo đôi và kéo dài về hai cực của tế bào.
Các nhiễm sắc thể đính với sợi tơ vô sắc ở tâm động và bắt đầu dịch chuyển về mặt phẳng xích đạo của tế bào.
Hình 2.3. Quá trình phân chia nguyên nhiễm ở tế bào rễ hành
A – Kỳ trung gian; B – Kỳ đầu; C – Kỳ giữa; D – Kỳ sau; E, F – Kỳ cuối
b. Kỳ giữa (Metaphase)
Các nhiễm sắc thể đóng xoắn và co ngắn cực đại, có hình dạng và kích thƣớc đặc trƣng. Các nhiễm sắc thể kép xếp thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc.
c. Kỳ sau (Anaphase)
Tâm động của nhiễm sắc thể tách đôi tạo ra hai nhiễm sắc thể đơn đi về hai cực của tế bào nhờ sự co giãn của sợi tơ vô sắc. Trƣờng hợp các nhiễm sắc thể bị mất tâm động, chúng không chạy đƣợc về haicực, bị bỏlại ở giữa tế bào.
d. Kỳ cuối (Telophase)
Ở đầu kỳ cuối các nhiễm sắc thể tụ lại ở 2 cực của tế bào và bắt đầu duỗi xoắn trở về dạng sợi mảnh nhƣ trạng thái ban đầu của nó và không quan sát rõ từng nhiễm sắc thể riêng rẽ. Màng nhân và nhân con đƣợc hình thành và cuối cùng, nhân trở lại trạng thái nhƣ ở kỳ trung gian.
(A) (B)
Hình 2.4. Sự hình thành vách ngăn chia tế bào mẹ thành hai tế bào con
A – Tế bào động vật; B – Tế bào thực vật
Song song với quá trình trên, tế bào chất phân chia kéo theo sự phân chia các bào quan (ty thể, lƣới nội chất…), lúc này ở giữa tế bào xuất hiện vách ngăn chia tế bào mẹ thành 2 tế bào con – hiện tƣợng này gọi là cytokinese. Ở tế bào động vật, vách ngăn hình thành theo kiểu eo thắt (từ ngoài vào và thắtvào phía tâm tế bào) khi phân đôi tế bào. Còn ở tế bào thực vật, do có màng xenlulô bao bọcnên vách ngăn đƣợc hình thành từ phía trong ra và phân tách thành hai tế bào con (Hình 2.4). Về mặt lý thuyết hai tế bào con có kích thƣớc bằng nhau. Tuy nhiên, sự phân chia tế bào chất bao gồm các nội bào quan, nói chung, ít nhiều mang tính chất ngẫu nhiên. Do đó, kích thƣớc tế bào ở hai tế bào con có thể không giống nhau.
Hình 2.5. Các kỳ phân chia nguyên nhiễmở tế bào rễ hành
Thời gian cần thiết để thực hiện quá trình phân chia nguyên nhiễm không giống nhau ở các tế bào và dao động từ 30 phút tới 5 giờ. Ở mỗilần phân chia, kỳ đầu chiếm thời gian lâu nhất rồi đến kỳ cuối, khoảng thời gian ngắn nhấtlà kỳ sau rồi đến kỳ giữa. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân bào nguyên nhiễm là 20 – 30oC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hƣởng tới quá trình phân bào.
Một trong những chỉ số đặc trƣng cho hoạt tính nguyên phân đó là chỉ số phân
bào hay chỉ số nguyên phân. Chỉ số nàyđƣợc xác định bằng tỷ lệ số lƣợng tế bào có nguyên phân trên tổng số tế bào đƣợc khảo sát. Chỉ số nguyên phân đƣợc biểu diễn bằng số phần nghìn (‰), nghĩa là bằng số lƣợng nguyên phân trên 1000 tế bào của nó.
Chỉ số phân bào đƣợc xác định nhƣ sau (Пухальский và cs., 2007): MI = (P + M + A + T)
P + M + A + T + I × 1000‰
Trong đó, MI – chỉ số phân bào; P, M, A, T, I – tƣơng ứng là số lƣợng tế bào trong kỳ đầu,kỳ giữa, kỳ sau, kỳ cuối, kỳ trung gian.
2.1.3. Ý nghĩa của nguyên phân
Nguyên phân chính là phƣơng thức sinh sản của tế bào, là cơ chế hình thành cơ thể mới từ hợp tử, đồng thời là cơ chế tái sinh các tế bào, mô và cơ quan trong cơ thể sinh vật đảm bảo cho sự sinh trƣởng của cơ thể;
Quá trình tái bản của ADN cũng nhƣ quá trình tái cấu trúc trên phân tử của sợi nhiễm sắc diễn ra trong chu kỳ tế bào là cơ hội cho sự thực hiện của các cơ chế điều hòa. Qua đó các gen, nhóm gen mới đƣợc hoạt hóa – hình thành nên các nhóm tế bào phân hóa theo chức năng ở cơ thể đa bào.
Trong nguyên phân, sự tự nhân đôi của các nhiễm sắc thể ở kỳ trung gian, rồi sau đó các nhiễm sắc thể này lại đƣợc phân chia đồng đều về hai cực của tế bào ở kỳ sau đã đảm bảo cho sự phân chia đồng đều vật chất di truyền của tế bào mẹ cho hai tế bào con, đảm bảo cho hai tế bào con giống hệt nhau và giống hệt tế bào mẹ.
Nhƣ vậy, bộ nhiễm sắc thể đặc trƣng của loài đƣợc ổn định trong các tế bào của cơ thể và qua các thế hệ cá thể ở loài sinh sản vô tính.
2.1.4. Hình thái và sốlƣợng nhiễm sắc thể
Trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn các sợi ADN kết hợp với protein và một sốthành phần khác tạo nên sợi nhiễm sắc thể có cấu trúc phức tạp. Nhiễm sắc thể có chu kỳ biến đổi cấu trúc về hình thái nhƣ co xoắn –duỗi xoắn ở chu kỳ tế bào.
Số lƣợng nhiễm sắc thể là dấu hiệu thứ nhất xác định tính đặc hiệu của kiểu nhân (là toàn bộ bộ nhiễm sắc thể của cơ thể, đƣợc xác định bởi độ lớn, hình dạng và số lƣợng nhiễm sắc thể).
Thông thƣờng nhiễm sắc thể đƣợc nghiên cứu ở kỳ giữa của phân chia nguyên nhiễm (hoặc nói chung ở giai đoạn phân bào mà ở đó có thể phân biệt rõ các nhiễm sắc
thể). Ở kỳ này nhiễm sắc thể có mức co xoắn lớn nhất và đƣợc quan sát rõ nhất dƣới kính hiển vi, trong tế bào chúng đƣợc phân biệt bởi hình dạng và độ lớn. Do có sự nhân đôi sợi nhiễm sắc để phân chia tế bào, nên nhiễm sắc thể ở kỳ giữa có cấu trúc hai thanh, gọi là hai sắc ty giống hệt nhau. Mỗi thanh là một sợi nhiễm sắc dài, co xoắn nhiều cấp tạo nên (hình 2.6). Hình thái nhiễm sắc thể thƣờng đƣợc chú ý đến các đặc điểm về chiều dài vai, vị trí của tâm động, sự có mặt của eo thứ cấp, và thể kèm (satel– lite) (hình 2.7).
Nhiễm sắc thể có thể có một hoặc 2 thể kèm. Thể kèm của nhiễm sắc thể khác nhau thì khác nhau về hình dạng, kích thƣớc và chiều dài của sợi liên kết với thân chính. Có nhiễm sắc thể có vai dài, nhiễm sắc thể khác lại có vai ngắn. Phần cuối của nhiễm sắc thể gọi là đầu mút (telomere). Những phần này không có khả năng liên kết với các phần khác của nhiễm sắc thể.
Hình 2.6. Các mức cấu trúc của nhiễm sắc thể
Hình 2.7. Cấu tạo nhiễm sắc thể
Nguồn: http://www.readorrefer.in/article/Structure–of–chromosome_1033/
Chiều dài bình thƣờng của mỗi nhiễm sắc thể và chiều dài tổng số tất cả các nhiễm sắc thể của kiểu nhân là ổn định. Hình thái của nhiễm sắc thể đƣợc xác định trƣớc hết bởi vị trí của tâm động. Các nhiễm sắc thể tâm cân có đặc điểm là tâm động nằm chính giữa và chiều dài hai vai bằng nhau hoặc gần bằng nhau. Các nhiễm sắc thể tâm lệch có tâm động nằm dịch về một phía và chiều dài vai khác nhau. Nhiễm sắc thể tâm mút thì tâm động nằm nằm gần đầu mút, còn nhiễm sắc thể tâm đầu có tâm động nằm ngay trên một đầucủa nhiễm sắc thể và chỉ có một vai (hình 2.8).
Hình 2.8. Các dạng nhiễm sắc thể
1, 7– dạng tâm cân; 2, 3 – dạng tâm lệch; 4, 5– dạng tâm mút; 6– dạng tâm đầu; 8– nhiễm sắc thể có eo thắt thứ cấp; 9– nhiễm sắc thể có thể kèm Nguồn: Самигуллина и Кирина, 2008
Để xác định mức độ không đều của các vai, cầntính tỷ lệ chiều dài vai dài so với chiều dài vai ngắn thông qua chỉ số vai (Ib) theo phƣơng pháp tính A. A. Prokofeeva, Bengovxkaia, V. M. Gindilis (1965):
Ib = 𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑣𝑎𝑖𝑑à𝑖
𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑣𝑎𝑖𝑛𝑔ắ𝑛
–Nếu tỉ lệ chiều dài vai bằng 1 –1,9 thì nhiễm sắc thể thuộc nhóm tâm cân. –Nếu tỉ lệ bằng 2 –4,9 thì thuộc nhóm tâm lệch.
– Còn khi tỉ lệ đo có giá trị ≥ 5 thì nhiễm sắc thể thuộc nhóm tâm mút (I. X. Nemxeva, 1970).
– Các nhiễm sắc thể có tỉ lệ chiều dài các vai lớn hơn 8 mà hình dạng vai ngắn gần giống hình cầu thì gọi là nhiễm sắc thể tâm đầu.
–Ngoài ra để nghiên cứu các nhiễm sắc thể có thểsử dụngnhiều chỉ tiêu khác: –Chiều dài tuyệt đối của mỗi nhiễm sắc thể tính bằng micromet (La).
– Chiều dài tƣơng đối của nhiễm sắc thể (Lr) đƣợc tính bằng phần nghìn hoặc phần trăm.
Lr = 𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑐ủ𝑎𝑛𝑖ễ𝑚𝑠ắ𝑐𝑡ể𝑛𝑔𝑖ê𝑛𝑐ứ𝑢
𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑐ủ𝑎𝑡ấ𝑡𝑐ả𝑐á𝑐𝑛𝑖ễ𝑚𝑠ắ𝑐𝑡ể ×100 ( hoặc nhân với 1000) –Chỉ số tâm động Ictính bằng %: Ic = 𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑣𝑎𝑖 𝑛𝑔ắ𝑛𝑐ủ𝑎𝑛𝑖ễ𝑚𝑠ắ𝑐𝑡ể 𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑐ả𝑛𝑖ễ𝑚𝑠ắ𝑐𝑡ể ×100 –Chỉ số xoắn Is tính bằng %: Is = 𝑡ổ𝑛𝑔𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑐ủ𝑎 2 𝑡ể𝑛𝑖ễ𝑚𝑠ắ𝑐𝑥𝑜ắ𝑛 𝑡ổ𝑛𝑔𝑐𝑖ề𝑢𝑑à𝑖𝑐ủ𝑎 2 𝑡ể𝑛𝑖ễ𝑚𝑠ắ𝑐𝑡ể𝑑à𝑖 ×100
Lưu ý: Để đưa ra kết luận cuối cùng về kích thước và cấu trúc của các nhiễm sắc thể phải dựa trên những dẫn liệu phân tích hơn 40 tế bào đang phân chia ở kỳ giữa trong 10 tiêu bản khác nhau sau khi đã xử lí thống kê.
Việc nghiên cứu hình thái và đếm số lƣợng nhiễm sắc thể của các kiểu nhân trong phòng thí nghiệm với thời gian ngắn có thể sử dụng các đối tƣợng thực vật có bộ nhiễm sắc thể ít, hình thái nhiễm sắc thể dễ phân biệt lẫn nhau. Thông thƣờng sử dụng các đối tƣợng: đậu Hà Lan (2n=14); dƣa chuột (2n=14); cúc dại (Crepis capillaris, 2n=6); hành (Allium cepa, 2n=16); arabidopsis(2n=6 hoặc 2n=10)…
2.2. CÁC BƢỚC LÀM TIÊU BẢN NÉN TẠM THỜI, QUAN SÁT CÁC PHA CỦA NGUYÊN PHÂN VÀ ĐẾM SỐLƢỢNG NHIỄM SẮC THỂ