Trong việc nghiên cứu tế bào thƣờng ứng dụng nhiều phƣơng pháp nghiên cứu sinh lý tế bào rất đơn giản và nhanh chóng, mất ít thời gian, dễ làm, lại cho kết quả
tƣơng đối chính xác. Những phƣơng pháp này đƣợc dùng nhiều nhất trong việc xác định sức sống của phôi trong hạt, sức sống, sức nảy mầm của hạt phấn, sự khác nhau về trạng thái sinh lý, sinh hóa học của hạt phấn, ống phấn và vòi nhụy…
Những phƣơng pháp này dựa trên cơ sở biến đổi hóa học của các chất trong tế bào để xác định tính chất sinh lý tế bào.Dƣới đây trình bày một vài phƣơng pháp đơn giản và thông dụng nhất.
4.2.1. Phƣơng pháp xác định sức sống của phôi
4.2.1.1. Vậtliệu
Hạt thầu dầu, hạt đậu đã ngâm cho trƣơng lên (để dễ cắt), hạt lạc… muối Mohr (là muốikép của sắt (II) và amoni sulfat, có công thức FeSO4.(NH4)2SO4.6H2O; là những tinh thể đơn tà, trong suốt, màu xanh lục; tan nhiều trong nƣớc, FeSO4trong dung dịch ít nhạy cảm với tác dụng của oxi trong không khí), axit sulfuric đậm đặc.
4.2.1.2. Các bước tiến hành
Hòa 1 hỗn hợp muối Mohr với axit sulfuric đậm đặc theo tỷ lệ với thể tích là 1:1. Sau mắthạt (phần có chứa phôi) lấy một lát mỏng bỏ vào giọt hỗnhợp trên đểmột lúc lâu nếu phôi còn có sức sống thì sẽ cho màu đỏ, nếu không còn sức sống thì sẽ cho màu vàng. Sở dĩ có hiện tƣợng đó là vì phôi hay mầm hạt, nếu còn sức sống thì phải chứa men heteroausin. Loại men này khi gặp loại thuốc thử trên sẽ cho phản ứng có màu đỏ. Vì vậy, nếu phôi có sức sống càng cao (nghĩa là càng có nhiều men heteroausin) càng cho màu đỏ thẫm hơn.
4.2.1.3. Yêu cầu đối với sinh viên
Thấy sự khác nhau về phản ứng biểu hiện màu sắc giữa phôi có sức sống và phôi không có sức sống. Từ đó ứng dụng phƣơng pháp này để tính tỷ lệ nảy mầm của hạt giống trong nông nghiệp.
4.2.2. Quan sát hình thái hạt phấn và xác định độ hữu dục của hạt phấn
Để quan sát đầy đủ và chính xác các giai đoạn phát triển của hạt phấn cần phải chọn lựa hoa ở các giai đoạn khác nhau. Có thể quan sát hình thái và xác định độ hữu dục của hạt phấn bằng cách nhuộm màu bởi dung dịch thuốc nhuộm KI (1%) hoặc thuốc axeto cacmin.
4.2.2.1. Quan sát hình thái và xác định độ hữu dục của hạt phấn bằng dung dịch
KI (1%)
Ở một số cây trồng, hạt phấn của chúng có lớp vỏ ngoài dày, rất khó quan sát đƣợc tinh tử khi nhuộm màu bằng axeto cacmin. Vì vậy thƣờng dùng phương pháp iot
để xác định độ hữu dục của hạt phấn. Bản chất của phƣơng pháp này dựa vào hàm lƣợng tinh bột trong hạt phấn nhờ phản ứng với dung dịch muối iốt. Độ hữu dục và bất dục của hạt phấn dựa vào sự chứa hàm lƣợng tinh bột. Thƣờng thì hạt phấn hữu dục sẽ
chứa đầy tinh bột, khi phản ứng với dụng dịch muối iốt sẽ cho màu xanh, còn hạt phấn bất dục sẽ chứa ít hoặc không có tinh bột, hạt phấn ít hoặc không có màu xanh.
Phƣơng pháp điều chế KI (1%): Cân 2 g iốt tinh thể, hòa tan tinh thể trong 5ml nƣớc nóng. Sau khi iốt tan hết, định mức dung dịch lên thể tích 300 ml và cho 1 g KI. Dung dịch này dễ bay màu nên cần phải giữtrong lọ có màu tối.
Các bướctiến hành: Phấn hoa thu nhận từ mẫu tƣơi ở các giai đoạn khác nhau (từ lúc mới thành nụ và khi hoa nở) đƣợc nhuộm bằng dung dịch KI (1%) nói trên. Sau đó quan sát dƣới kính hiển vi, từ đó xác định hạt phấn hữu dục và bất dục. Tính tỷ lệ hạt phấn hữu dục.
4.2.2.2. Quan sát hình thái và xác định độ hữu dục của hạt phấn bằng axeto cacmin
Khi nhuộm hạt phấn chín bằng axeto cacmin, có thể quan sát thấy các nhân sinh dƣỡng và nhân sinh dục trong hạt phấn. Thông thƣờng các nhân này đƣợc nhuộm màu đỏ nâu khác với tế bào chất có màu đỏ nhạt hoặc màu hồng. Ở cây ngô, hạt phấn có hình tròn, có thể thấy rõ hai nhân sinh dục và một nhân sinh dƣỡng, và một lỗ nhỏ nơi ống phấn sẽ phát triển.
A) (B)
Hình 4.2. Hạt phấn ngô sau khi nhuộm màu bằng axeto cacmin
A – hạt phấn hữu dục, 1 – tinh tử; B – hạt phấn bất dục, 1 – hạt phấn bị tách vỏ, 2 – nhân sinh dưỡng và nhân sinh sản bị chết
Các bướctiến hành: Thu thập phấn hoa tƣơi từ cây ở các giai đoạn phát triển khác nhau (từ lúc mới hình thành nụ và khi hoa nở). Sau đó chọn bao phấn đƣa lên lam kính và dùng kim mũi mác cán cho vỡ bao phấn để hạt phấn bung ra. Nhỏ một giọt axeto cacmin để nhuộm màu. Chú ý các bao phấn ở các thời kỳ phát triển khác nhau đƣợc thực hiện riêng để dễ phân biệt.
Quan sát dƣới kính hiển vi và đếm số hạt phấn hữu dụcvà bất dục, tính tỉ lệ hạt phấn hữu thụ để đánh giá sức sống hạt phấn trong mẫu đã thực hiện.
4.2.3. Phƣơng pháp xác định sức sống của hạt phấn
Sức sống của hạt phấn có thể xác định bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau, có thể dùng các thuốc thử hóa học để gây phản ứng mẫu với các loại enzym có trong hạt phấn
hay xác định dựa vào tính chất của nguyên sinh chất tế bào, hoặc cũng có thể thử bằng cách gieo hạt phấn ngay trong môi trƣờng nhân tạo.
4.2.3.1. Dựa vào phản ứng với các loại enzym có trong hạt phấn
a. Phương pháp B. X. Sadarcov (Пухальский và cs., 2007)
Phƣơng pháp này thực hiện dựa trên cơ sở lý luận là trong hạt phấn sống (hạt phấn có sức nảy mầm) có chứa nhiều enzym peroxidase. Loại enzym này nếu tác dụng với thuốc thử benzidin sẽ cho màu đỏ. Vậy nếu khi cho hạt phấn vào dung dịch benzidin hạt phấn có màu đỏ thì có thể kết luận là hạt phấn này có sức sống, màu đỏ nhạt hay đậm là sức sống mạnh hay yếu. Nếu sau khi bỏ vào dung dịch benzidin hạt phấn vẫn không cho màu đỏ có nghĩa là hạt phấn ấy đã mất sức sống.
Quá trình thực hiện: Điều chế riêng 4 loại dung dịch sau: + 0,2 g benzidin trong 100 ml cồn 50o.
+ 0,15 g α–naftol trong 100 ml cồn 50o. + 0,25 g Na2CO3 trong 100 ml nƣớc cất. + Dung dịch 0,5 % H2O2.
Ba dung dịch đầu hòa lẫn vào nhau theo tỷ lệ 1:1:1 về thể tích. Lấy 1 giọt hỗn hợp này cho lên lam kính, bỏ phấn hoa vào giọt thuốc thử này sau đó nhỏ thêm lên đấy 1 giọt dung dịch H2O2 0,5%. Đƣa lên kính hiển vi để quan sát. Những hạt phấn nào cho màu hồng là hạt phấn sống, hạt phấn không cho màu là hạt phấn đã bị chết.
b. Phương pháp P. I. Diaconu (Пухальский và cs., 2007)
Sự hô hấp của tế bào liên quan chặt chẽ với quá trình sống và tồn tại của enzym dehydrogenase. Khi quá trình hô hấp ngừng sẽ dẫn tới tế bào bị chết và enzyme này sẽ không đƣợc tổng hợp. Trong số các enzym hô hấp có thể dễ dàng xác định sự thay đổi hoạt độngcủa enzym succinatedehydrogenase (nằm bên trong màng của ty thể)với sự trợ giúp của dung dịch không màu triphenyltetrazolium clorua (2,3,5 – triphenyltetrazolium clorua, viết tắt là TTC). Khi có mặt của enzym succinate dehydrogenase thì dung dịch triphenyltetrazolium clorua sẽ chuyển thành một dạng thuốc nhuộm (formazan), tế bào sẽ có màu đỏ. Trong trƣờng hợp quá trình sống bị ngừng, sẽ không diễn ra sự chuyển thành thuốc nhuộm và dung dịch không có màu.
Quá trình thực hiện nhƣ sau:
– Chuẩn bị 0,5 hoặc 1% dung dịch TTC vào 1/15 M dung dịch đệm phosphate Xerenxen với pH = 7,17(xem mục II.2.3.2);
–Mang hạt phấn lên lam kính và nhỏ 1–2 giọt dung dịch TTC;
–Đậy lamen và đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC khoảng 20– 30 phút;
– Quan sát dƣới kính hiển vi khoảng 3 – 5 tiêu bản với 5 trƣờng quan sát khác nhau của mỗi tiêu bản và tính tỷ kệ hạt phấn nhuộm màu trên tổng số hạt phấn quan sát ở các trƣờng quan sát.
Hạt phấn có màu đỏ là hạt phấn có sức sống, hạt phấn chết sẽ không bắt màu và có màu vàng.
Phƣơng pháp P. I. Diaconu đã đƣợc nghiên cứu và đƣa ra ở Đại học Nông nghiệp quốc gia Nga, và đƣợc đánh giá là một trong những phƣơng pháp tốt nhất khi nghiên cứu về sức sống hạt phấncủa nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau.
4.2.3.2. Dựa vào tính chất của nguyên sinh chất tế bào (Phương pháp B. A. Iursep)
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc thẩm thấu chọn lọc, nguyên sinh chấtcủa tế bào sống có khả năng hấp thụ có chọn lọc đối với các chất khác, còn nguyên sinh chất của tế bào chết không có khả năng này. Vì vậy tế bào sống thƣờng không hấp thụ các loại thuốc nhuộm màu, còn tế bào chết lại nhuộm rất nhiều. Dùng phƣơng pháp này để xác định sức sống của hạt phấn rất tốt, nhất là đối với những hạt phấn không nảy mầm đƣợc trong môi trƣờng nhân tạo(Пухальский và cs., 2007).
–Quá trình thực hiện cầnđiều chế 2 dung dịch:
+ Dung dịch erytrozin trong nƣớc, nồng độ 1/5000.
+ Dung dịch đệm phosphate Sorensen với pH = 7,17 hay 7,38. – Điều chế dung dịch đệm phosphate Sorensen nhƣ sau:
Đểđiều chế 10 ml dung dịch đệm phosphate Sorensen có nồng độ pH = 7,17 cần lấy dung dịch 1/15 Na2HPO4.2H2O thêm vào 3 ml dung dịch 1/15 KH2PO4.
Muốn điều chế dung dịch đệm phosphate Sorensen có nồng độ pH = 7,38 thì lấy hỗn hợp của 2 dung dịch trên với tỷ lệ tính theo thể tích là 8:2.
Trên kính lam nhỏ 1 giọt dung dịch đệm, trộn phấn hoa tƣơi vào đấy. Sau đó nhỏ thêm 1 giọt dung dịch erytrozin mới điều chế vào. Lấy đũa thủy tinh trộn đều để nhƣ vậy khoảng từ 2 đến 5 phút thì đậy lamen lại. Để thêm 5 phút nữa (không để quá 15– 20 phút).
Tính tỷ lệ hạt phấn không nhuộm màu trên toàn bộ phận sẽ có tỷ lệ hạt phấn không có sức sống.
4.2.3.3. Phương pháp thử nảy mầm hạt phấn trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo
a. Phương pháp buồng ẩm Van – Tigem (Пухальский và cs., 2007)
Buồng ẩm Van–Tigem có cấu tạo gồm một ống hình trụ tròn bằng thủy tinh có đƣờng kính 12 – 15 mm, chiều cao 6 – 8 mm và dày 1,5 – 2 mm. Cả hai đầu trên và dƣới của ống này đều phẳng, một đầu đƣợc gắn vào giữa lam kính bởi vazơlin hoặc parafin, đầu còn lại (phía trên) đƣợc đẩy bởi lamen. Dƣới đáy của ống hình trụ nhỏ 1 giọt nƣớc, còn mặt dƣới của lamen nhỏ 1 giọt dung dịch môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo (hình 4.3). Lamen đậy cũng đƣợc gắn với ống hình trụ bởi vazơlin. Nếu không có ống hình trụ bằng thủy tinh có thể sửdụng ống làm bằng giấy với nhiều lớp, các lớp này đƣợc gắn với nhau bởi parafin.
Hình 4.3. Buồng ẩm Van–Tigem để cấy phấn
Nguồn: Пухальский et al., 2007
Để chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng cấy phấn cần điều chế dung dịch agar 1% trong nƣớc đƣờng 5 – 40%, nồng độ đƣờng phụ thuộc vào tính chất của từng loại phấn (ví dụ đối với đậu Hà Lan, ngô, khoai tây và một số cây khác là 10– 15%). Đểđiều chế dung dịch này, ngâm 1 g agar trong 100 ml nƣớc cất để agar trƣơng lên. Sau đó đun sôi cho đến khi agar hòa tan toàn bộ trong nƣớc, bỏ thêm vào dung dịch đang sôi 10– 20 g đƣờng glucose hay sacarose, khuấy đều cho đến khi đƣờng tan hết. Đôi khi cho thêm dung dịch 0,008% axit boric (H3BO3).
Trên lamen sạch nhỏ1 giọt dung dịch môi trƣờng còn nóng và cấy nhanh hạt phấn vào đó. Chú ý cấy sao cho hạt phấn đƣợc rải đều trên môi trƣờng. Sau đó đảo lamen lại và đậy lên ống trụ của buồng ẩm. Lúc này hạt phấn đƣợc nằm bên trong buồng ẩm. Buồng ẩm này đƣợc đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 20– 30oC, sau khoảng 1 tiếngcó thể lấy ra quan sát dƣới kính hiển vi.
Đếm số lƣợng hạt phấn nảy mầm (có xuất hiện ống phấn) trong 5 – 10 trƣờng quan sát, từ đó tính tỷ lệ sống của hạt phấn. Ống phấn phải có chiều dài không nhỏ hơn đƣờng kính của hạt phấn.
b. Phương pháp D. A.Trancopski (Пухальский và cs., 2007)
Phƣơng pháp này chỉ dùng cho những loại phấn dễ nảy mầm trong môi trƣờng nhân tạo. Các bƣớc chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo tƣơng tự nhƣ ở phƣơng pháp buồng ẩm.
Khi môi trƣờng vừa nấu xong, còn nóng, nhỏ một giọt môi trƣờng lên lam kính rồi dựng đứng lam kính cho giọt môi trƣờng chạy đều tạo thành lớp mỏng trên kính. Đặt lam kính trở lại bình thƣờng, đợi cho đến khi môi trƣờng đặc lại. Sau đó, rải (cấy) đều hạt phấn lên môi trƣờng ở lam kính này. Đặt mẫu vào đĩa petri và đậy lại. Chú ý đặt giấy lọc có thấm nƣớc vào đĩa petri để giữ ẩm cho mẫu.
Ủ đĩa petri trong tủ ấm có nhiệt độ khoảng 25 – 30oC sau khoảng 30 phút đến 1 giờcó thể lấy ra quan sát. Có thể nhỏ lên mẫu 1 giọt axeto cacmin để dễ quan sát hơn.
Đem tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi trong 5 –10 trƣờng quan sát. Đếm số hạt phấn nảy mầm và không nảy mầm, số hạt phấn nảy mầm có và không có nhân sinh dục trong ống phấn trong một vài thị trƣờng kính hiển vi.
4.2.4. Yêu cầu đối với sinh viên
– Quan sát và vẽ các dạng hạt phấn khác nhau của một số loại cây trồng. –Quan sát và vẽ chú thích hạt phấn hữu dục và hạt phấn bất dục của chúng.
– Thực hiện mẫu để xác định sức sống phấn hoa ở một số cây: Cây lúa, cây ngô và cây đậu tƣơng.
– Xác định độ hữu dục của hạt phấn ở cây lúa, cây ngô và cây đậu tƣơng bằng phƣơng pháp nhuộm màu với KI (1%) hoặc axeto cacmin.
Đối tượng
nghiên cứu Màu đỏ Màu hồngSố hạt phấnKhông màu Tổng số Tỉ lệ hữu dục
– Xác định sự nảy mầm của hạt phấn của hạt phấn hoa cây lúa, cây ngô và cây đậu tƣơngtrong môi trƣờng dinh dƣỡngnhân tạo.
Đối tượng nghiên cứu Số hạt phấn nảy mầm Số hạt phấn không nảy mầm Tổng số Có nhân
PHẦN B - QUY LUẬT DI TRUYỀN CỦA TÍNH TRẠNG
Bài 5. PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TÍNH TRẠNG CHẤT LƢỢNG
Mục đích nắmđược đặc điểm của phương pháp phân tích di truyền để nghiên cứu bản chất di truyền ở mức cơ thể. Phân tích di truyền tính trạng chất lượng nhằm đánh giá tính trạng do một gen kiểm soát và hai gen kiểm soát. Áp dụng phép kiểm định Khi
bình phương (χ2) để đánh giá kết quả.