7.1.1. Chọn đối tƣợng xử lý
Khi nghiên cứu quá trình phát sinh đột biến thựcnghiệm một trong những vấn đề quan trọng đề ra là phải chọn lựa và tìm hiểu vai trò của giống cây trồng, xem nó nhƣ một nhân tố ảnh hƣỏng đến tần số và phổ đột biến. Việc xác định sự phụ thuộc giữa kiểu gen biểu hiện ở nhữngđặc tính hình thái, sinh học của giống và những đặc trƣng của quá trình đột biến, cho phép sử dụng một cách có hiệu quả hơn phƣơng pháp gây đột biến thực nghiệm vào chọn giống. Nắm đƣợc vấn đề này, có thể dự đoán sớm hơn về sựxuất hiện những kiểu đột biến nào đó dƣới tác dụng của những tác nhân gây đột biến (mutagen) nhất định.
Một số nghiên cứu về quá trình đột biến trong điều kiện tự nhiên và thực nghiệm cho thấy, chẳng những ở những dạng cây khác nhau có sự thay đổi về tần sốxuất hiện đột biến mà ngay trong một gen cũng có sự thay đổi về khả năng biến dị với những alen
khác nhau. Trên cơ sở của nhiều nghiên cứu thực nghiệm khác nhau, có thể đi đến những kếtluận nhƣ sau:
1) Các loạicây khác nhau đƣợc đặc trƣng bằng tính đột biến của nó;
2) Càng gần nhau về kiểu gen, nguồn gốc phát sinh... thì có tần số và phổ đột biến
càng giống nhau và ngƣợc lại. Sự phụ thuộc giữa kiểu gen và các đặc trƣng của quá trình phát sinh đột biến tuân theo qui luật về dãy biến dị tƣơng đồng của Vavilop (1920). Dựa vào quy luật này, sau khi nghiên cứu quá trinh phát sinh đột biến ở những
dạng đại diện đặc trƣng cho một nhóm sinh thái này hay nhóm sinh thái khác ta có thể dự đoán đƣợc trƣớc khả năng xuất hiện những kiểu đột biến nhất định trong một quần
thể có liên quan.
Tính đặc trƣng của các kiểu gen khác nhau chỉ thể hiện rõ ràng khi tiến hành với một khối lƣợng vật liệu lớn, với tác dụng của những mutagen có những liều lƣợng nhƣ
Cần chú ý là, sự biểu hiện của kiểu hình của đột biến có thể thay đổi do ảnh hƣởngcủa điều kiện ngoại cảnh, nhất là khí hậu.
Chọn vật liệu ban đầu để chọn giống và nghiên cứu đột biến cũng quan trọng nhƣ chọn các dạng làm bố mẹ trong chƣơng trình lai tạo. Mặc dù cho đến nay, chƣa chủ động chi phối hoàn toàn quá trình phát sinh đột biến, nhƣng việc chọn đối tƣợng phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu hoặc chọn giống.
Khi nghiên cứu di truyền, nên chọn những giống địa phƣơng hoặc giống chọn lọc đã trải qua hàng chục năm ở cây tự thụ phấn. Khi muốn tạo ra quần thể đa dạng hơn về kiểu gen để nâng cao hiệu quả chọn lọc thì xử lí các cơ thể lai F1hoặc ở các thế hệ tiếp
theo (Đặng Hữu Lanh và cs., 1984).
7.1.2. Phƣơng pháp xử lý bằng tác nhân vật lý
Các tác nhân vật lý có khả năng gây đột biến ở cơ thể sinh vật là những dạng phóng xạ có khả năng ion hoá mạnh. Theo phƣơng thức truyền năng lƣợng, phân các dạng phóng xạ thành hai loại: 1) Phóng xạ hạt– là những dòng nguyên tử và hạt sơ cấp chuyển động với tốc độ thayđổi, đƣợc đặc trƣng bằng khối lƣợng điện tích và tốc độ,
nhƣ tia α, tia β; 2) Phóng xạ điện từ – là sóng điện từ phát ra trong không gian ở dạng dao dộng điện từ và từ trƣờng, nhƣ tia Rơnghen (tia X), tia γ. Tia γ đƣợc sử dụng nhiều trong gây đột biến nhân tạo ở thực vật, nhiều giống lúa đột biến chịu hạn, chịu úng, kháng sâu bệnh, năng suất cao, chất lƣợng tốt đƣợc tạo ra nhờ xử lý đột biến bằng tia γ.
7.1.2.1. Xử lý vậtliệubằng tác nhân vật lý
Tia phóng xạ có tác dụng khác nhau đến thực vật tuỳ thuộc vào kiểu phóng xạ, liềulƣợng phóng xạ, đặc tính di truyền của giống, trạng thái sinh lý –sinh hoá của bộ phậnđƣợc xử lý và một sốyếu tố của môi trƣờng ngoài. Tùy theo hình thức sinh sản mà dùng các phƣơng phápxử lý khác nhau.
Ở cây sinh sản hữu tính (cây lƣơng thực, cây rau và cây lấy dầu) xử lý phóng xạ
trên hạt khô, hạt ƣớt và hạt mầm đang ở các pha khác nhau của chu kì tế bào.
Hạt khô, hạt ƣớt và hạt nảy mầm đƣợc trải thành một lớp trên trƣờng hiếu. Đảm bảo điều kiện lúc chiếu xạ cũng giống điều kiện trƣớc và sau khi phóng xạ (cho tới khi gieo hạt).
Nhiều quốc gia sử dụng trƣờng gamma hoặc ống phóng Rơnghen để xử lý ở bất kỳ thời điểm nào của cây.Đặc biệt xử lí giai đoạn tiền phôi cho tần số đột biến cao và
phổ đột biến rộng.
Ở cây sinh sản bằng cơ quan sinh dƣỡng (chồi, mầm, nhánh, thân, rễ v.v…) xử lý
các cơ quan nói trên với liều lƣợng nhỏ hơn khi xử lý trên hạt.
Để xử lý hạt phấn ở những cây cho nhiều phấn, thƣờng đựng phấn trong phong bì bằng giấy hoặc polyetylen (ngô, thuốc lá, hoa hƣớng dƣơng) rồi mang xử lý phóng xạ. Ở những cây cho ít hoặc khó lấy phấn, nên phóng xạ cả chùm hoa hoặc nụ hoa.Thậm
Bảng 7.1. Liều lƣợng xử lý đột biến phóng xạ trên một số cây trồng
TT Cây trồng Đối tượng xử lý Tác nhân Liều lượng xử lý
1 Lạc Hạt khô Tia γ 12 – 30 krad 2 Đậu tương Hạt khô Tia γ 10 – 22 krad
3 Lúa Hạt khô Tia γ 60 krad
4 Ngô Hạt khô Hạt phấn Tia γ Tia γ 10 – 25 krad 14 – 28 krad
5 Đậu Hà Lan Hạt phấn Tia γ 10 krad
6 Khoai tây Lá (in vitro) Phiến lá (in vitro) Đầu rễ (in vitro) Tia X Tia X Tia γ 1,5 – 2 krad 2,25 – 2,75 krad 2,5 – 3,5 krad 7 Táo Mắt ghép ở thời kỳ ngủ Chồi lá non Tia γ Tia γ 6 – 7 krad 2,5 – 5 krad 8 Cam Mô sẹo (in vitro) Tia γ 6 – 16 krad 9 Chuối Đỉnh sinh trưởng, chồi (in vitro) Tia γ 1 – 2,5 krad 10 Mía Từng chồi riêng Tia γ 3,5 – 7 krad 11 Khoai lang Đỉnh sinh trưởng (in vitro) Tia γ 20 krad
Tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng mà chúng đòi hỏi những liều lƣợng chuẩn khác
nhau. Liều lƣợng chuẩn là liều lƣợng mà ở đấy ởthế hệ M1 có từ 30–40% cây sống sót
và ra hoa kết quả. Ví dụ, liều lƣợng phóng xạ chuẩn của phần lớn cây nông nghiệp là từ
5 – 7kR đến 80 – 100kR (với tia Rơnghen và tia γ); lúa 75kR; ngô 10kR, đậu tƣơng 20kR, đậu Hà Lan 5 – 10kR, cà chua 20kR, khoai tây 5 – 10kR; dƣa hấu 40kR; củ cải
100kR – 200kR.
Đôi khi để tích luỹ đột biến, cần dùng phƣơng pháp chiếu xạ lặp lại nhiều lần. Theo Hofman, nếu hạt đƣợc chiếu xạ liền tiếp trong 3 – 4 thế hệ thì số lƣợng đột biến xuất hiện lớn hơn 3 lần so với trƣờng hợp chỉ chiếu xạ một lần.
7.1.2.2. Xác định độ cảm ứng phóng xạ của đối tượng xử lý
Tính mẫn cảm với phóng xạ là một chỉ tiêu quan trọng về phản ứng của cây đối với phóng xạ. Tính mẫn cảm phóng xạ làmức độ rối loạn của các quá trình khác nhau
và sự hủy hoại của mô do kết quả tác độngcủa một liều lƣợng phóng xạ. Đặc điểm này
rất khác nhau ở nhiều cây trồng.
Để so sánh mức độ cảm ứng phóng xạ của các loài sinh vật, dùng đơn vị là liều lƣợng gây chết 50% (LD50) hoặc liều lƣợng khủng hoảng hay tới hạn. Ở liều lƣợng này, 50% số cá thể bị phóng xạ sẽ sống đến lúc trổ bông và thu hoạch.
Ở động vật, cũng dùng LD50 nhƣng theo dõi hiệu quả của liều lƣợng này trong thời gian 30 ngày đầu (LD50/30).
Độ cảm ứng phóng xạ của một loài phụ thuộc vào kiểu gen, trạng thái sinh lí của cơ thể, lứa tuổi, giới tính, điều kiện môi trƣờng trong và sau khi xử lí.
7.1.3. Phƣơng pháp xử lý bằng tác nhân hóa học
Mặc dù ra đời sau, song việc sử dụng các hoá chất gây đột biến vào mục đích
nghiên cứu di truyền học và chọn giống đãđƣa lại những kết quả lớn và có nhiều triển vọng. Các hoá chất gây đột biến có khả năng gây ra những thay đổi trong cấu trúc của nhiễm sắc thể và gen. Các chất này gây ra những đột biến ở thực vật với tần số cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các tác nhân hóa học gây đột biến khi tác động đến tế bào có hiệuquả cao hơn, gây ra những biến đổi tinh vi hơn và đặc hiệu hơn các tác nhân vật lý. Nếu nhƣ dùng các dạng phóng xạ tác dụng lên cây trồng thì ở chúng xuất hiện khoảng 10– 15% biến dị có sức sống; còn với hoá chất gây đột biến, thì con số ấy lên đến 30– 60%. Có quan niệm cho rằng các tác nhân vật lý thƣờng gây ra những biến dị
sai hình nhiễm sắc thể,còn các tác nhân hoá học thì thƣờng tạo những đột biến điểm. Các tác nhân hóa học bao gồm các chất oxy hóa khử và các gốc tự do (H2O2, axit nitro HNO2; foocmandehyd HCOH; các aldehyde và các muối kim loại nặng); các chất
alkyl hóa (ethylmethan sunfonat – EMS; diethylsuphat – DES; dimetylsuphat – DMS; ethylenimin – EI; nitrosoethyl urea – NEU; nitrosomethyl urea – NMU); các đồng đẳng của bazơ nitơ (cafein; 5–bromuracil – 5–BU; aminopurine; aminopterin, các hợp chất chứa halogen…); các chất cảm ứng với bazơ (ethylurethan; 5–aminouracil;
teobromin…); các chất nhóm acridin C13H9N –nhóm thuốc nhuộm (proflavine).
Các tia phóng xạ có khả năng xuyên thấu mạnh vào các mô của cơ thể, trong khi ấy các hợp chất hoá học có thể bị giữ lâu trênbề mặt của hạt và trong một thời gian dài không xâm nhập đƣợc vào tế bào phôi. Bởi vậy, ở những nồng độ và phƣơng pháp xử lý khác nhau sẽ đƣa đến những hiệu quả tác dụng rất khác nhau của các tác nhân hoá học.
Do vậy, tùy thuộc vào từng loại đối tƣợng câytrồng và vật liệu xử lý và lựa chọn những nồng độ cho phù hợp.
Hiệu quả gây đột biến bằng xử lý các tác nhân hóa học phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Mutagen trong dung dịch hay ở pha khí, pH dung dịch, các đối tƣợng và trạng thái sinh lí, giai đoạn phát triển, vv…Ngoài ra, hiệu quả ấy còn chịu ảnh hƣởng của tốc độ phân huỷ của các hóa chất trong dung dịch và độc tính của các chất đƣợc hình thành.
Bảng 7.2. Nồng độ xử lý đột biến hóa học trên một số cây trồng
TT Cây trồng Đối tượng xử lý Tác nhân Nồng độxử lý
1 Cà chua Hạt khô EMS 0,8% (24h, 24oC)
2 Đậu Hà Lan Hạt khô DES 0,2% (15h, 20oC)
3 Khoai tây Củ, bẹ, cuống hoa EMS 100 – 500 ppm
4 Khoai lang Đỉnh sinh trưởng EI 0,5% (3h)
Các tác nhân hóa học là những hợp chất dễ bị phân hủy, chỉ có thể giữ đƣợc hoạt tính khi bảo quản trong tủ lạnh (đến +4oC), trong các ống tiêm kín hay trong các lọ thủy
đƣợc một năm. Tuy nhiên, có những chất gây đột biến nhƣ dietylsunfat (DES), dimetylsunfat (DMS) có thể giữ đƣợc nhiều năm ở nhiệt độ 24 – 25oC; đây là những chất gây đột biếncó hiệu quả đột biến không cao.
Để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến, dung dịch nên chuẩn bị trƣớc lúc sử dụng không quá 30 phút và giữ trong bóng tối suốt thời gian xử lí.
Các tác nhân hóa học gây đột biến thƣờng rất độc, dễ gây ra hiện tƣợng nhiễm độc máu khi thấm qua da, nhiễm đọc qua đƣờng hô hấp khi hít phải chất gây đột biếnở pha
khí. Các chấtgây đột biếnthấm thấu vào mô cơ thể gây ung thƣ.
Có thể xử lý vật liệu bằng dung dịch hoặc pha khí:
7.1.3.1. Xử lí bằng dung dịch
a. Xử lí hạt
Ngâm hạt khô trong dung dịch chất gây đột biến ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc tính nhạy cảm đối với tác dụng của hóa chất gây đột biến. Tính nhạy cảm đối với các chất gây đột biếnở cây trồngđƣợc sắpxếp nhƣ sau: Đậu tƣơng, đậu Hà Lan, lúa mì,
lúa , ngô, khoai tây, kê, cà chua, bầu bí, dƣa chuột…
Xử lý ở 22o– 24oC trong 2 –24 giờ tùy thuộc hạt có vỏ dày hay mỏng, khô hay dễ thấm dung dịch, hạt khô hay đã hút nƣớc bão hòa và đang ở các pha khác nhau của chu kì giảm phân đầu tiên.
Thời gian xử lý hợp lý nhất đối với cây họ đậu là từ 6– 12 tiếng; đối với cây hòa thảo là từ 12– 18 tiếng; đối với cây hạt có vỏ dày (dƣa chuột, bầu bí) là 24 tiếng.
Lấy một trọng lƣợng dung dịch gấp 5–10 lần lần so với trọng lƣợng hạt. Cũng có thể sử dụng 0,5–1 ml dung dịch/1 hạt (tùy theo mức độ to nhỏcủa hạt).
Hạt sau khi xử lý trong dung dịch đƣợc gói vào túi vảimỏng hoặc vảimàn để rửa
dƣớivòi nƣớc máy chảy từ 30 phút – 60 phút. Rửa sau khi xử lý có tác dụng làm sạch chất gây đột biến còn dƣ ở vỏ hạt và trong tế bào, lƣợng chất gây đột biến còn dƣ sẽ biến tính, phối hợp với một số chất trong tế bào sẽ gây độc, làm chết phôi hạt hoặc làm giảm khả năng nảy mầm của hạt.
Hạt sau lúc xử lý phải đƣợc gieo ngay. Nếu nhƣ hạt sau lúc xử lý chƣa đƣợc gieo ngay, thì sau đấy 3–4 ngày sẽ trƣơng lên và bắt đầu thối và chết. Nếu hạt sau khi xử lý phải gửi đi xa là ngâm hạt trong dung dịch xử lý 2–6 giờ, tiếp theo làm khô không khí và có thể gieo sau 5 – 10 ngày.
b. Xử lí cơ quan sinh dưỡng
Xử lí cành giâm, chồi, đỉnh cành, đỉnh sinh trƣởng của thân, củ… bằng cách
nhúng chúng vào dung dịch chất gây đột biến.
Cũng có thể nhỏ giọt dung dịch chất gây đột biến hoặc lấy một cục bông có chất gây đột biến đặt trên cơ quan sinh dƣỡng. Để tránh chất gây đột biến bay hơi và biến
tính nhanh, nên phủ trên bông bằng giấy không thấm nƣớc. Sau 6 –8 giờ lại thêm dung
c. Xử lí cơ quan sinh sản
Có thể xử lý bầu nhụy bằng cách tiêm dung dịch chất gây đột biến vào bầu lúc
hoa hình thành hợp tử hoặc ở thời kỳđầu của quá trình hình thành phôi hạt, có thể buộc lọcó chứa chất gây đột biếnvào cây rồi nhúng cả chùm hoa đã khử đựcvào đó.
7.1.3.2. Xử lý mutagen ở pha khí
Xử lý hạt, cành giâm, củ, hạt phấn… có thể tiến hành nhƣ sau: Bỏ chất gây đột biến vào đây bình hút ẩm rồi đóng kín. Ở phần giữa, đặt một tấm lƣới thép, trên đó có trải một lớp hạt, cơ quan sinh dƣỡng của cây hoặc hạt phấn.
Thời gian xử lý phụ thuộc vào mức độ bay hơi của chất gây đột biến. Đối với etylenimin (EI) thời gian xử lí 10 – 15 phút (0,5 ml trong bình hút ẩm 3 lít); đối với
DMS là 48 – 72 giờ (10 ml trong bình hút ẩm 3 lít) ; đối với các hợp chất nitro 2 – 4 ngày (1 g chất gây đột biếntrong bình hút ẩm 3 lít).