2. Đối t−ợng
2.3.1.Chỉ tiêu lâm sàng
Tất cả các bệnh nhân nghiên cứu của chúng tôi đều là những bệnh nhân nằm viện tại Khoa Lâm sàng các bệnh máu C5- Viện HHTM Trung −ơng đ−ợc chẩn đoán lần đầu và ch−a điều trị hoá chất, gồm cả hai giới nam và nữ với lứa tuổi ≥ 16, có các triệu chứng nh− sau:
- Sốt - Thiếu máu - Xuất huyết - Hội chứng u - Nhiễm trùng 2.3.2. Chỉ tiêu xét nghiệm
Nhóm bệnh nhân nghiên cứu đ−ợc lựa chọn có chẩn đoán là thể M3 lần đầu theo tiêu chuẩn của FAB về ph−ơng diện hình thái học và hoá học tế bào nh− sau [12].
a) Tế bào học (hình thái học)
+ ≥ 30% các tế bào có nhân trong tuỷ là blast dạng tiền tuỷ bào bất th−ờng tăng sinh các hạt đặc biệt màu −a azua, quan sát rất dễ dàng bằng kính hiển vi quang học. Một số blast có thể Auer.
+ Nếu là thể M3v: các tế bào blast có hình thái giống tiền mono nh−
nhân lớn, cuộn, chia thuỳ, đối xứng, ít thấy hạt nhân, các hạt đặc hiệu rất nhỏ, hoặc không thấy (phải dùng kính hiển vi điện tử). Một số ít blast cũng có thể Auer (H.2.1).
H.2.1. Tế bào blast của Lơxêmi tiền tuỷ bào nhuộm Giemsa
a) Tế bào Lơxêmi tiền tuỷ bào trong nguyên sinh chất có nhiều thể Auer xếp thành bó, kèm theo nhiều hạt thô.
b) Tế bào blast thể M3v: tế bào giống mono, nhân to, cuộn, nhân đối xứng (hình g−ơng). NSC có ít hạt đặc hiệu, hạt nhỏ, th−ờng phải quan sát d−ới kính hiển vi điện tử. Thể nay th−ờng kháng với ATRA.
c) Nhuộm Esterase không đặc hiệu, tế bào M3 bắt màu vàng cam.
b) Hoá tế bào
- PAS : âm tính [(hoặc (+) lan toả)] - Myeloperoxydase : d−ơng tính (+)
- Sudan đen : d−ơng tính (+) C
c) Xét nghiệm đông - cầm máu
- Định l−ợng các yếu tố đông máu: F-V, VII, VIII,… PT, APTT, fibrinogen, D-dimer (xem thêm phần kỹ thuật).
- Đếm số l−ợng tiểu cầu
- Làm các xét nghiệm thăm dò DIC: Nghiệm pháp Ethanol, FDP…
d) Xét nghiệm miễn dịch (các phenotype = CD của bạch cầu tuỷ)
- CD34+ (dấu ấn của tế bào tiền tuỷ bào) - CD38-;CD34-;CD14-.
- CD7-; CD3-
- Xét nghiệm nhiễm sắc thể (NST)
Nuôi cấy tế bào làm xét nghiệm NST, tìm các dạng biến đổi nh− chuyển chỗ: t (15; 17), mất đoạn.
- Nghiên cứu khả năng thực bào của bạch cầu trung tính: Sử dụng kỹ thuật thực bào với tụ cầu và hạt latex tr−ớc và sau lui bệnh hoàn toàn, nhằm đánh giá chất l−ợng của bạch cầu trung tính sau lui bệnh (xem thêm phần kỹ thuật).
2.3.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán các hội chứng và tiên l−ợng
* Hội chứng thiếu máu: Thiéu máu khi HST < 120g/l. Dựa vào mức HST cần >80g/l để đảm bảo hoạt động bình th−ờng tối thiểu cho các cơ quan mà chúng tôi coi thiếu máu tới mức HST ≥ 80g/l là mức độ nhẹ, 80 > HST > 60g/l là mức độ vừa và HST < 60g/l là mức độ nặng [74].
* Hội chứng đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC)
Tiêu chuẩn chẩn đoán: giảm tiểu cầu, có 3 trong số các xét nghiệm sau: tỷ lệ prothrombin giảm, FDP (+), nghiệm pháp r−ợu (+), fibrinogen giảm, thời gian thromboplastin từng phần hoạt hoá có thể kéo dài. Đặc biệt nghiệm pháp r−ợu d−ơng tính rất có giá trị [8, 37].
* Hội chứng tiêu sợi huyết: Để đánh giá tình trạng này chúng tôi dựa vào: fibrinogen giảm nặng, nghiệm pháp Von-kaulla (+), các chỉ số khác trong giới hạn bình th−ờng (trừ số l−ợng tiêu cầu) [8, 37]. Do rối loạn đông máu trong leukemia cấp thể M3 có nhiều yếu tố tác động và không đủ ph−ơng tiện xét nghiệm nên chúng tôi không đặt ra phân biệt giữa tiêu fibrin tiên phát và thứ phát sau đông máu nội mạch rải rác.
* Tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn (67)
- Lâm sàng: Hết sốt, toàn trạng tỉnh táo, ăn ngủ tốt, không xuất huyết. - Xét nghiệm máu: số l−ợng HC, TC, bạch cầu trung tính trở lại bình th−ờng cả về số l−ợng và chất l−ợng, không có tế bào blast ở máu ngoại vi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xét nghiệm tuỷ: Sinh máu trở lại bình th−ờng, tế bào blast < 5%, dòng bạch cầu trung tính biệt hoá bình th−ờng.
- Xét nghiệm NST: không còn chuyển đoạn t (15; 17). - Xét nghiệm đông máu: trở về bình th−ờng.
* Tiêu chuẩn đánh giá chất l−ợng sống lâu dài (5-8 năm).
- Toàn trạng bình th−ờng, trở lại lao động và làm việc theo nghề cũ, cân nặng, xây dựng gia đình và khả năng sinh đẻ.
- Tiến hành xét nghiệm: các xét nghiệm máu, tuỷ, đông - cầm máu, NST hoàn toàn bình th−ờng, không có tế bào bệnh trong tuỷ.
- Xét nghiệm khả năng thực bào của bạch cầu trung tính (tế bào tr−ởng thành của tiền tuỷ bào bị bệnh).
* Tiêu chuẩn đánh giá tác dụng phụ lâu dài của ATRA và AS2O3
- Đánh giá chức năng gan: Protein (albumin), đ−ờng huyết, các men gan (GOT, GPT).
- Đánh giá chức năng thận: Urê máu, creatimin. - Máu: các thể bất th−ờng trong HC, BC, TC. - Da: Sẫm, ngứa, các tổn th−ơng da khác. - Thị lực…
2.4. Các kỹ thuật sử dụng cho nghiên cứu này
2.4.1. Lấy mẫu xét nghiệm
- Lấy máu tĩnh mạch không chống đông dùng để làm tiêu bản máu đàn, lấy 1ml máu tĩnh mạch có chống đông bằng EDTA K3 để đọc các chỉ số tế bào máu ngoại vi bằng máy đếm tế bào tự động.
+ Sát trùng, gây tê vùng định chọc tuỷ (th−ờng là ở gai chậu sau trên) bằng xylocain 2%.
+ Dùng kim cỡ nòng 18 gause chọc xuyên qua màng x−ơng khoảng 0,3cm, tháo nòng kim.
+ Dùng bơm tiêm 5ml hút 0,5ml dịch tuỷ x−ơng dùng làm tiêu bản máu đàn, nhuộm giemsa và hoá học tế bào, phần có chống đông EDTA K3 dùng để đếm số l−ợng tế bào bằng máy đếm tế bào tự động và làm xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp.
+ 0,2ml tiếp sau hút vào bơm tiêm có chống đông bằng heparin sau đó bơm vào ống chứa 3ml môi tr−ờng Parker 199 trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.
- Các xét nghiệm đ−ợc làm trong vòng 6h kể từ khi chọc tuỷ.
2.4.2. Kỹ thuật nhuộm giemsa
- Tiêu bản máu đàn để khô. - Cố định bằng cồn 960. - Nhuộm giemsa hai thì.
2.4.3. Kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào
- Kỹ thuật nhuộm peroxydase
* Nguyên lý: D−ới tác dụng của peroxydase, hydorgen - peroxid (H2O2) sẽ tạo ra một nguyên tử oxy, nguyên tử này sẽ lập tức oxy hoá benzidin, tạo chất tủa có màu trong nguyên sinh chất của bạch cầu.
* Kỹ thuật: nhuộm theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm tuỷ x−ơng Viện HHTM Trung −ơng.
* Kết quả: Phản ứng d−ơng tính thể hiện bằng các hạt màu gỉ sắt nằm trong nguyên sinh chất của tế bào.
- Kỹ thuật nhuộm sudan đen
* Nguyên lý: Chất màu sudan đen có khả năng hoà tan trong lipid nên có thể dùng để phát hiện thành phần lipid trong tế bào.
* Kỹ thuật: Nhuộm theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm tuỷ x−ơng Viện HHTM Trung −ơng.
* Kết quả: Phản ứng d−ơng tính biểu hiện bằng các hạt màu đen nằm trong nguyên sinh chất của tế bào.
- Kỹ thuật nhuộm P.A.S
* Nguyên lý: d−ới tác dụng của periodic, nhóm chức r−ợu của glycogen đ−ợc chuyển thành aldehyt, chức aldehyt mới sẽ có tác dụng với thuốc tử Schiff cho màu hồng trong nguyên sinh chất tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Kỹ thuật: Nhuộm theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm tuỷ x−ơng Viện HHTM Trung −ơng.
* Kết quả: Phản ứng d−ơng tính bằng màu hồng lan toả hoặc các hạt tím đỏ trong nguyên sinh chất tế bào.
- Kỹ thuật nhuộm Esterase không đặc hiệu
* Nguyên lý: Trong điều kiện nhiệt độ pH thích hợp, d−ới tác dụng của men esterase, cơ chất naphtol ASD acetat đ−ợc chuyển thành naphtol tự do. Chất này kết hợp với muối diazo để tạo ra một chất có màu.
* Kỹ thuật: Nhuộm theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm tuỷ x−ơng Viện HHTM Trung −ơng.
* Kết quả: phản ứng d−ơng tính biểu hiện bằng những hạt màu ghi sẫm nằm trong nguyên sinh chất của tế bào.
* Nhuộm esterase không đặc hiệu có chất ức chế cũng t−ơng tự nh−ng trong dung dịch cơ chất - diazo cho thêm NaF (5mg cho 1ml).
2.4.4. Kỹ thuật nhuộm hồng cầu l−ới
* Kỹ thuật: Nhuộm theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm tuỷ x−ơng Viện HHTM Trung −ơng.
* Đọc kết quả trên 1.000 hồng cầu.
2.4.5. Nguyên tắc đọc huyết tuỷ đồ
Dùng máy đếm tế bào đọc các chỉ số
- Máu ngoại vi: số l−ợng hồng cầu, HST, hematocrit, MCV, MCH, MCHC, số l−ợng bạch cầu, số l−ợng tiểu cầu.
Dùng kính hiển vi quang học
- Làm công thức bạch cầu máu ngoại vi, tế bào tuỷ trên tiêu bản. - Tính tỷ lệ hồng cầu l−ới máu ngoại vi và tuỷ.
- Đánh giá tình trạng phản ứng của các tế bào blast với các ph−ơng pháp nhuộm hoá học tế bào.
2.4.6. Kỹ thuật xác định dấu ấn màng tế bào
- Tiến hành kỹ thuật theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm tuỷ x−ơng Viện HHTM Trung −ơng.
- Đọc kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang b−ớc sóng 495mm, vật kính 40. + Các anti CD gắn FITC (CD3, CD10) bắt màu xanh lục.
+ Các anti CD gắn PE (CD19, CD5, CD14, CD33, CD16/56) bắt màu da cam. + Mẫu chứng đều gắn cả FITC lẫn PE.
- Đánh giá tỷ lệ tế bào blast d−ơng tính.
* Đánh giá kết quả:
- Thể M3 cho kết quả CD33 d−ơng tính và âm tính với các CD còn lại.
2.4.7. Kỹ thuật nuôi cấy và phân tích nhiễm sắc thể tuỷ
* Chuẩn bị môi tr−ờng: 6,4ml dung dịch Parker 199 1,6ml huyết thanh AB
* Kỹ thuật chọc hút dịch tuỷ và nuôi cấy NST đ−ợc thực hiện theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng dị truyền Viện HHTM.
* Nhuộm tiêu bản
- Nhuộm giemsa hai thì xác định: số l−ợng NST, những thay đổi lớn về hình dạng nhiễm sắc thể.
- Nhuộm băng R nhằm đánh giá tổn th−ơng từng nhiễm sắc thể cụ thể.
2.4.8. Kỹ thuật làm các xét nghiệm đông máu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu nghiệm là 5ml máu tĩnh mạch, lấy vào ống nhựa có chống đông natri citrate 3,8% tỷ lệ 1/10, để lắng, lấy huyết t−ơng làm các xét nghiệm: thời gian Howell, tỷ lệ phức hệ prothrombin, APTT, nghiệm pháp Ethanol, nghiệm pháp tiêu euglobulin, bán định l−ợng FDP.
3-4ml máu tĩnh mạch, lấy vào 2 ống nghiệm không chống đông đ−ợc tráng NaCl 0,9% để làm các xét nghiệm thời gian máu đông và co cục máu đông.
1.5ml máu có chống đông để làm xét nghiệm sợi huyết theo ph−ơng pháp biure tại Phòng xét nghiệm sinh hoá Bệnh viện Bạch Mai.
+ Thời gian máu chảy: ph−ơng pháp Duke
+ Thời gian máu đông: ph−ơng pháp Lee - White + Đếm số l−ợng tiểu cầu: Bằng máy đếm tế bào + Co cụ máu đông:
- Sử dụng 2 ống máu khi làm thời gian máu đông, để trong thùng cách thuỷ 370C, theo dõi hiện t−ợng co cục máu.
- Kết quả đọc sau 2 giờ: cục máu không co, co không hoàn toàn, co hoàn toàn, cục đông tan.
+ Thời gian Howell hay thời gian phục hồi canxi của huyết t−ơng giàu tiểu cầu.
* Đánh giá đông máu tổng quát theo con đ−ờng nội sinh.
* Kỹ thuật thực hiện theo quy trình hiện đang áp dụng tại phòng xét nghiệm đông máu Viên HHTM.
* Đánh giá kết quả: bình th−ờng đông sau 1'30" - 2'15" + Tỷ lệ phức hệ prothrombin
* Đánh giá các yếu tố theo đ−ờng ngoại sinh II, VII, IX, X.
* Kỹ thuật thực hiện theo quy trình hiện đang áp dụng tại Phòng xét nghiệm đông máu - Viện HHTM.
* Đánh giá kết quả: Kết quả đọc trên bảng kết quả mẫu, chênh lệch cho phép giữa các ống của cùng bệnh nhân là 0,5-1 giây. Tỷ lệ phức hệ prothrombin bình th−ờng khi ≥ 70%.
+ Thời gian prothrombin từng phần hoạt hoá (APTT).
* Đánh giá con đ−ờng đông máu nội sinh, loại bỏ phụ thuộc vào tiểu cầu bằng cách cho thêm cephalin (đóng vai trò nh− yếu tố 3 tiểu cầu) và kaolin (thống nhất hoạt độ) vào thuốc thử.
* Kỹ thuật thực hiện theo quy trình hiện đang áp dụng tại Phòng xét nghiệm đông máu - Viện HHTM.
* Đánh giá kết quả:
- Kết quả chênh lệch cho phép giữa các ống của cùng bệnh nhân là 1 giây. - Khi kết quả kéo dài hơn > 15% so với chứng thì đ−ợc gọi là bệnh lý. + Nghiệm pháp Ethanol
* Chứng minh sự có mặt của các phức hệ hoà tan trong đông máu nội mạch rải rác.
* Đánh giá kết quả:
Nếu có sự hình thành gel hoặc đông là kết quả d−ơng tính. Nếu không có tủa vẫn trong là âm tính.
+ Nghiệm pháp tiêu euglobulin
* Toan hoá huyết t−ơng để tách euglobulin, loại bỏ tất cả các thành phần ức chế tiêu cục đông sau đó cho euglobulin trở lại, theo dõi quá trình tiêu euglobulin để đánh giá hệ thống hoạt hoá plasminogen.
* Kỹ thuật thực hiện theo quy trình hiện đang áp dụng tại Phòng xét nghiệm đông máu - Viện HHTM.
* Đánh giá kết quả:
- Tan hoàn toàn: tr−ớc 15 phút - Tiêu sợi huyết tối cấp 15 - 30 phút - Tiêu sợi huyết nặng 30 - 45 phút - Tiêu sợi huyết vừa 45 - 60 phút - Tiêu sợi huyết nhẹ > 60 phút - Bình th−ờng
+ Bán định l−ợng FDP
* Chứng minh sự có mặt của các sản phẩm thoái giáng fibrinogen và fibrin trong huyết t−ơng.
* Thuốc thử: Dùng thuốc thử theo nguyên lý ng−ng kết latex của hãng Biomérieur. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.9. Kỹ thuật thực bào
- Tế bào thực bào: Bạch cầu trung tính tách từ máu ngoại vi (theo kỹ thuật HHM, 2006).
- Đối t−ợng thực bào: Tụ cầu trắng và hạt latex. - Các chỉ tiêu đánh giá kết quả:
+ Tỷ lệ phần trăm các tế bào có thực bào (trong NSC có đối t−ợng thực bào) trong 100 tế bào bạch cầu đếm đ−ợc.
+ Chỉ số thực bào: số l−ợng trung bình tụ cầu bị thực bào trên tổng số tụ cầu bị thực bào trong các bạch cầu có thực bào.
+ Tỷ lệ vi trùng bị tiêu huỷ trong thực bào đ−ợc đánh giá bằng ph−ơng pháp nhuộm màu bằng Acrydin arange d−ới kính hiển vi huỳnh quang tế bào chết bắt màu vàng, tế bào sống bắt màu xanh (H.2.2).
2.5. Ph−ơng pháp nghiên cứu
Tiến cứu, cắt ngang, hồi cứu, theo dõi dọc.
tóm tắt mô hình nghiên cứu
đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh IPL
* Ký hiệu: c, d, e, f các nội dung nghiên cứu.
2.5.2. Tiến hành nghiên cứu
2.5.2.1. Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm: Theo các chỉ tiêu nghiên cứu đã mô tả phần trên (2.3).
2.5.2.2. Nghiên cứu điều trị M3 bằng ATRA: ứng dụng theo ph−ơng pháp của Huang Trung Quốc đã mô tả (88). Uống mỗi ngày 40mg, uống liên tục
Bệnh nhân vào viện
Lơxêmi cấp - Chẩn đoán phòng khám Lơxêmi cấp M3, M3V - Tuỷ đồ - Hóa tế bào, MD: các CD
- Phân loại FAB lơxêmi dòng tuỷ (AML)
Các thể: M0 M1 M2 M3, M3V M4, M4E M5a, 5b M6 M7
- Đông máu (DIC) - NST: t (15; 17), ... - MD: CD33 + , CD13 Mô tả đặc điểm LS và xét nghiệm
H.2.3. Tóm tắt mô hình nghiên cứu chẩn đoán và điều trị
Lơxemi cấp thể tiền tuỷ bào (M3) bằng ATRA và Arsenic trioside
Điều trị bằng ATRA - Tỷ lệ LBHT - Tỷ lệ tái phát - Tỷ lệ tử vong * Theo dõi dọc kết quả LBHT Đánh giá kết quả điều trị bằng ATRA > 5 năm Tái phát sau ATRA
Điều trị bằng As2O3
c d
e
f
trong 3 tháng, sau đó duy trì 9 tháng với liều 20mg/ngày. Tháng đầu cứ 1 tuần 2 lần kiểm tra CTM và các chỉ số đông máu. Theo dõi tác dụng phụ: Khô miệng, rụng tóc, hội chứng ATRA.
Do đây là nghiên cứu lần đầu ở n−ớc ta, nên đề tài chia làm hai b−ớc: b−ớc 1 điều trị thăm dò trên 11 b/n, b−ớc sau tiếp tục ph−ơng pháp trên điều