* Cấy đổ: ứng dụng để đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thử. - Ghi thông tin trên hộp lồng (đĩa petri)
- Dùng micropipette hút 10 µl, 100 µl hoặc 1.000 µl lượng mẫu thử (tùy theo lượng vi sinh vật có trong mẫu thử) cho vào hộp lồng trống.
- Đổ khoảng 15 ml môi trường thạch đã đun chảy và để nguội 45 - 47oC vào đĩa petri. - Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ để trộn đều mẫu thử với
môi trường thạch và để đông tự nhiên. - Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Hết thời gian ủ đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên mặt thạch và tính kết quả.
Hình 1B.11. Thao tác cấy đổ đĩa thạch11
10Nguồn: Microbilogy-Lab-Manual 2016
4.3. Phân lập và nhận dạng vi khuẩn trên đĩa thạch
Cấy ria, cấy trải hay cấy đổ đĩa sau thời gia ủ tạo thành khuẩn lạc riêng lẻ thuần khiết, chọn những khuẩn lạc này để xác định tính chất sinh lý, sinh hóa và định danh giống, loài vi khuẩn. Sử dụng kính hiển vi để quan sát hình dạng, kích thước, cách sắp xếp, cấu trúc của tế bào vi khuẩn sau khi nhuộm màu.
Một số đặc điểm vi khuẩn trên đĩa thạch như sau:
Màu sắc: Một số vi khuẩn tạo khuẩn lạc có màu đặc trưng: - Màu vàng: Staphylococcus aureus
- Vàng chanh: Sarcina lutea
- Trong như hạt sương: Streptococcus
- Sản sinh sắc tố xanh tiết ra môi trường: Pseudomonas aeruginosa
Hình dạng:
- Quan sát bìa khuẩn lạc: Tròn, đa giác, răng cưa, chia thùy.
- Quan sát chiều cao: bằng, cao - bằng, lồi thấp, lồi cao, lồi có chỏm.
Kích thước: nhỏ, to.
Mùi: (đặt hộp cách xa 20 - 25 cm) vi khuẩn kỵ khí sinh H2S có mùi trứng thối.
Hình 1B.12. Một số đặc điểm hình dạng vi khuẩn trên đĩa thạch12
B. THỰC HÀNH
1. Quan sát sự di động của vi khuẩn E. coli bằng phương pháp giọt ép. 2. Quan sát và mô tả hình thái một số vi khuẩn nhuộm.
3. Nhuộm, quan sát vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và vẽ hình. 4. Thao tác cấy ria vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa.
5. Báo cáo kết quả thực tập.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Vật kính có độ phóng đại …... lần dùng để quan sát vi khuẩn di động.
2.Để quan sát vi khuẩn sau khi đã nhuộm màu, sử dụng vật kính có độ phóng đại …... lần dùng.
3. Ốc sơ cấp để…... 4. Ốc thứ cấp để…...… 5. Phẩm nhuộm được phân loại dựa vào:
A. Bản chất của ion mang màu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B. Tính chất vật lý của ion mang màu C. Tính chất hóa học của ion mang màu D. Khả năng hấp thụ của ion mang màu
6. Trong qui trình nhuộm Gram, giai đoạn nào là quan trong nhất: A. Giai đoạn tẩy cồn
B. Cố định vết bôi C. Chủng vi khuẩn D. Toàn bộ qui trình 7. Nguyên tắc nhuộm đơn
A. Methylene blue kiềm nhuộm được các hạt biến sắc của các trực khuẩn
B. Vi khuẩn bắt màu Gram âm do sự khác biệt của cấu trúc vách tế bào vi khuẩn C. Vi khuẩn bắt màu Gram dương do sự khác biệt của cấu trúc vách tế bào vi khuẩn D. Sự nhuộm màu sẽ dễ dàng với tác nhân nhuộm màu mạnh
8. Nguyên tắc nhuộm kép
A. Methylene blue kiềm nhuộm được các hạt biến sắc của các trực khuẩn
B. Vi khuẩn bắt màu Gram âm hoặc Gram dương do sự khác biệt của cấu trúc vách tế bào vi khuẩn
C. Sự nhuộm màu sẽ dễ dàng với tác nhân nhuộm màu mạnh D. Khó tẩy bởi các tác nhân tẩy mạnh như cồn pha axit loãng 9. Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương có màu:
A. Hồng C. Đỏ
B. Tím D. Cam
10. Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram âm có màu:
A. Hồng C. Đỏ
Bài 2
CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN Mục tiêu học tập
Bài này giúp người đọc:
1. Phân biệt được tụ cầu và liên cầu khuẩn.
2. Định danh S.aureus và Staphylococci coagulase (-).
3. Phân biệt được liên cầu nhóm A, liên cầu nhóm B và xác định phế cầu, S.pyogenes, S.agalactiea.
I. CẦU KHUẨN GRAM DƯƠNG GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP 1.1. Staphylococci (Tụ cầu khuẩn)
Vi thể: Staphylococci có hình cầu, đường kính ≈ 1 µm, bắt màu nhuộm Gram dương và tụ thành đám giống hình chùm nho.
Tăng trưởng:
- Mọc dễ dàng trên các môi trường thông thường như thạch dinh dưỡng (NA: Nutrient Agar), canh dinh dưỡng (NB: Nutrient Broth).
- Môi trường Mannitol Salt Agar (MSA) là môi trường chọn lọc dành cho Staphylococci
vì có chứa 7,5 - 9% NaCl. Ở môi trường nồng độ muối cao này ức chế sự phát triển các vi khuẩn khác chỉ có Staphylococci phát triển được.
Chi Staphylococci có ít nhất 30 loài, trong đó 4 loài rất hay gặp trên lâm sàng là: S. aureus,
S.epidermidis, S.haemolyticus, S.saprophyticus.
1.2. Streptococci (Liên cầu khuẩn)
- Vi thể: Streptococci hình cầu hay bầu dục, bắt màu nhuộm Gram dương, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau, vi khuẩn có thể đứng thành đôi một hoặc riêng lẻ, ít khi tụ thành đám.
- Tăng trưởng: Streptococci được nuôi trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng, ví dụ thạch máu cừu (BA: Blood Agar), thạch nâu (CA: Chocolate Agar), canh tim óc hầm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(BHI: Brain Heart Infusion), trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2. Trên thạch máu chúng tiêu huyết β, α, hoặc γ. Liên cầu nhóm D và Enterococci mọc được ở 6,5% NaCl.
* Streptococcus pneumoniae (Phế cầu khuẩn)
- Hình cầu, Gram dương, xếp thành đôi, hình mũi giáo, có thể xếp thành chuỗi ngắn. - Trên môi trường thạch máu gây tiêu huyết α. Dễ bị ly giải bởi các chất hoạt động bề
mặt như muối mật. Nhạy cảm với optochin (thử nghiệm Taxo P).
* Cầu khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp (Neisseria)
Vi thể: Neisseria thuộc họ Neisseriaceae, bắt màu nhuộm Gram âm, xếp thành đôi, hai mặt lõm quay vào nhau giống hình hạt cà phê.
Tăng trưởng: Mọc trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng như BA, CA, BHI, MTM (Modified Thayer - Martin) ở 35 - 37oC trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2.
Hai loài có vai trò quan trọng trong y học: N. meningitidis (Meningococcus - Não mô cầu) và N. gonorrhoae (Gonococcus - Lậu cầu). Dòng gây bệnh thường nằm bên trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính (nội bào).
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ định danh cầu khuẩn13
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ định danh nhóm Streptococci
II. CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN2.1. Thử nghiệm Catalase 2.1. Thử nghiệm Catalase
2.1.1. Mục đích
Thử nghiệm này giúp phân biệt tụ cầu - Staphylococci và liên cầu - Streptococci.
2.1.2. Nguyên tắc
Enzyme Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và khí oxy. Vi khuẩn tiết men catalase sẽ cho thử nghiệm dương tính.
2.1.3. Cách tiến hành
Nhỏ một giọt H2O2 (3%) lên trên lame kính sạch, dùng vòng cấy nhựa lấy một ít vi khuẩn mọc trên thạch Nutrion Agar cho vào giọt H2O2.
2.1.4. Đọc kết quả
Có hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn, ghi nhận Catalase dương tính. Kết luận là tụ cầu khuẩn - Staphylococci.
Nếu không có hiện tượng sủi bọt, ghi nhận catalase âm tính. Kết luận là liên cầu khuẩn
- Streptococci.
Lưu ý: Khi lấy vi khuẩn trên thạch máu nên lấy một ít ở phần trên của khóm vi khuẩn, tránh tiếp xúc với môi trường vì hồng cầu có khả năng làm thử nghiệm Catalase cho kết quả dương tính giả.
Hình 2.1. Thử nghiệm Catalase14
2.2. Thử nghiệm Mannitol
2.2.1. Mục đích
Thử nghiệm Mannitol để phân biệt S.aureus với Staphylococci khác (S.epidermidis).
2.2.2. Nguyên tắc
Trên môi trường chọn lọc Mannitol Salt Agar (MSA), S. aureus có khả năng lên men đường mannitol, axit hóa môi trường nên chỉ thị đỏ phenol chuyển sang vàng.
2.2.3. Cách tiến hành
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn S.aureus từ ống Nutrient Agar (NA), cấy zic-zac lên mặt thạch nghiêng ống MSA thứ nhất. Đốt tiệt trùng que cấy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn S.epidermidis từ ống NA, cấy zic-zac lên mặt thạch nghiêng ống MSA thứ hai. Đốt tiệt trùng que cấy.
Ủ cả 2 ống nghiệm vừa cấy ở 35oC/18-24 giờ.
2.2.4. Đọc kết quả:
Đĩa MSA 1 chuyển sang màu vàng → vi khuẩn S.aureus lên men đường mannitol. Đĩa MSA 2 vẫn giữ nguyên màu đỏ → S.epidermidis không lên men đường mannitol.
Hình 2.2. Thử nghiệm Mannitol15 Hình 2.3. Thử nghiệm Coagulase16
2.3. Thử nhiệm Coagulase
2.3.1. Mục đích
Thử nghiệm phân biệt S.aureus với các loài Staphylococci khác.
2.3.2. Nguyên tắc
Enzyme coagulase của vi khuẩn hiện diện dưới hai dạng là dạng liên kết (clumping factor) và dạng tự do (free coagulase). Enzyme này gây nên hiện tượng lợn cợn hoặc đông đặc huyết tương khi tiếp xúc.
2.3.3. Cách tiến hành
- Trên lame: Tìm coagulase liên kết
Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame, lấy vài khóm vi khuẩn trộn với giọt nước cất để tạo huyền dịch vi khuẩn. Sau đó nhỏ một giọt huyết tương bên cạnh rồi trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Trong vòng 10 giây, xuất hiện những hạt lợn cợn, ghi nhận thử nghiệm coagulase dương tính.
Lưu ý:
Để lâu hơn 10 giây có thể xảy ra kết quả dương tính giả.
Thử nghiệm coagulase trên lame âm tính đều phải tiến hành tìm coagulase tự do.
- Trong ống nghiệm: Tìm coagulase tự do.
Lấy hai ống nghiệm có chứa 0,5 ml canh cấy S.aureus và S.epidermidis. Nhỏ lần lượt 0,5 ml huyết tương thỏ (pha loãng 1:5) vào hai ống nghiệm trên, trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Đem ủ cách thủy 37oC/4 giờ.
2.3.4. Đọc kết quả
Sau 1 - 4 giờ nếu có hiện tượng đông đặc huyết tương ghi nhận thử nghiệm coagulase dương tính. Kết luận S. aureus.
Lưu ý:
S. aureus: làm đông đặc huyết tương; S. epidermidis: không làm đông huyết tương.
Nếu sau 4 giờ huyết tương không đông phải ủ tiếp ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18 giờ. Có thể dùng huyết tương người nếu không có huyết tương thỏ.
2.4. Thử nghiệm ngưng tụ latex nhanh
2.4.1. Mục đích
Xác định hiện tượng ngưng kết hạt giữa kháng thể đặc hiệu khi gặp kháng nguyên tương ứng của vi khuẩn với sinh phẩm thử nghiệm.
2.4.2. Nguyên tắc
Những hạt nhựa latex dạng nano được phủ một lớp kháng thể đặc hiệu sẽ ngưng kết khi gặp kháng nguyên tương ứng. Staphytect Plus là bộ kit thử nhanh dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể, dùng để phát hiện đồng thời coagulase dạng liên kết (clumping factor), protein A, và polysaccharide của nang vi khuẩn Staphylococcus aureus.
2.4.3. Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên tấm bìa, cho những hạt nhựa latex đã được phủ kháng thể đơn dòng đặc hiệu tiếp xúc với vi khuẩn Staphylococci. Lắc nhẹ tấm bìa 30 giây.
2.4.4. Đọc kết quả
Dương tính: trong vòng 20 giây, các hạt latex sẽ kết tụ khi gặp kháng nguyên tương ứng đặc hiệu → vi khuẩn là Staphylococcus aureus.
Âm tính: Không xảy ra hiện tượng ngưng kết, vi khuẩn là Staphylococci khác.
Lưu ý: Phản ứng dương tính giả có thể xuất hiện sau 40 giây.
2.5. Thử nghiệm tiêu huyết (HEMOLYSIN)
2.5.1. Mục đích
Xác định các kiểu tiêu huyết của vi khuẩn.
2.5.2. Nguyên tắc
Một số vi khuẩn như Staphylococci, Steptococci có khả năng tiết hemolysin làm ly giải hồng cầu tạo vòng tiêu huyết đục mờ hay trắng trong xung quanh khuẩn lạc.
2.5.3. Cách tiến hành
Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn Staphylococci hoặc Steptococci từ ống NA cấy ria 3 chiều lên hộp thạch máu cừu. Đem ủ 37oC/18 - 24 giờ.
2.5.4. Đọc kết quả
Xung quanh khóm vi khuẩn mọc trên hộp thạch máu xuất hiện vòng sáng tiêu huyết do hồng cầu bị ly giải chứng tỏ vi khuẩn có tiết ra hemolysin. Có 3 kiểu tiêu huyết α, β, γ.
* Kiểu tiêu huyết α: trên môi trường thạch máu vi khuẩn ly giải không hoàn toàn hồng cầu tạo vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh màu xanh xung quanh khuẩn lạc.
* Kiểu tiêu huyết β: trên môi trường thạch máu vi khuẩn ly giải hoàn toàn hồng cầu tạo vòng tiêu huyết sáng, trong xung quanh khuẩn lạc.
* Kiểu tiêu huyết γ: trên môi trường thạch máu vi khuẩn không ly giải hồng cầu nên không tao vòng tiêu huyết.
Hình 2.4. Thử nghiệm tiêu huyết16
2.6. Thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin (TAXO A)
2.6.1. Mục đích
Phân biệt Streptococci tiêu huyết β nhóm A và Streptococci tiêu huyết β nhóm B.
2.6.2. Nguyên tắc
Streptococci tiêu huyết β nhóm A nhạy cảm với bacitracin. Thử nghiệm này phân biệt
Streptococci tiêu huyết β nhóm A với Streptococci tiêu huyết β thuộc B.
2.6.3. Cách tiến hành
Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt lên đó đĩa Taxo A là đĩa giấy tẩm 0,04 IU Bacitracin. Ủ 350C/18 - 24 giờ trong bình nến.
2.6.4. Đọc kết quả
- Xung quanh đĩa Taxo A có vòng vô khuẩn → thử nghiệm Taxo A dương tính. Kết luận là vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β, nhóm A (Streptococcus pyogenes).
- Ngược lại thì Taxo A âm tính, phải tiến hành tiếp theo thử nghiệm CAMP để xác định
Streptococci tiêu huyết β, nhóm B. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.5. Thử nghiệm TAXO A17 Hình 2.6. Thử nghiệm CAMP18
2.7. Thử nghiệm CAMP (Christie, Atkins và Munch – Peterson)
2.7.1. Mục đích
Xác định vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β nhóm B.
2.7.2. Nguyên tắc
Streptococci tiêu huyết β nhóm B tiết ra một protein gọi là yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với β-lysin của S. aureus.
2.7.3. Cách tiến hành
Cấy một đường thẳng dòng vi khuẩn S. aureus có sinh β-lysin lên mặt thạch máu cừu. Sau đó vạch một đường cấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β thẳng góc với đường cấy S. aureus nhưng cách 1 - 2 mm.
Ủ 35oC/18 giờ hoặc 35oC/6 giờ trong bình nến.
2.7.4. Đọc kết quả
Điểm tiếp giáp 2 đường cấy vi khuẩn S. aureus và Streptococci tạo vùng tiêu huyết rộng và sáng hơn, có dạng hình cánh cung/vảy cá → thử nghiệm CAMP dương tính. Kết luận là vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β, nhóm B (S.agalactiae).
2.8. Thử nghiệm nhạy cảm Optochin (TAXO P)
2.8.1. Mục đích
Xác định vi khuẩn Streptococci tiêu huyết α nhóm B.
2.8.2. Nguyên tắc
S.pneumococci nhạy cảm với Optochin nên xung quanh đĩa Taxo P xuất hiện vòng vô khuẩn. Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn này để phân biệt S.pneumococci với các Streptococci
tiêu huyết α khác (ví dụ Streptococcus viridans).
17Nguồn: Chp.12 Biochemicals-Taxo A Test
2.8.3. Cách tiến hành
Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết α trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa Taxo P là đĩa giấy tẩm 5 µg Optochin. Ủ 35oC/18 giờ trong bình nến.
2.8.4. Đọc kết quả
Xung quanh đĩa Taxo P xuất hiện vòng vô khuẩn có đường kính ≥ 14 mm → thử nghiệm Optochin dương tính. Kết luận: cầu khuẩn này là S. pneumonia (Phế cầu khuẩn).
Lưu ý: Nếu đường kính vòng kháng khuẩn <14 mm cần tiến hành làm thử nghiệm tan trong muối mật để xác định Pneumococci.
Hình 2.6. Thử nghiệm TAXO P19
2.9. Thử nghiệm kháng Novobiocin
2.9.1. Mục đích
Dựa vào thử nghiệm này để phân biệt S.saprophyticus và Staphylococci không tiết coagulase khác.
2.9.2. Nguyên tắc
S. saprophyticus đề kháng tự nhiên với novobiocin, xác định đặc điểm này để khẳng định tính kháng novobiocin của vi khuẩn bằng đĩa giấy có tẩm 5 µg novobiocin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.9.3. Cách tiến hành
- Dùng que gòn trải đều vi khuẩn Staphylococci không tiết coagulase lên hộp thạch Muller-Hinton Agar (MHA).
- Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa giấy tẩm 5 µg novobiocin. - Ủ 35oC/18 - 24 giờ.
2.9.4. Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô khuẩn, nếu < 16mm → vi khuẩn đề kháng novobiocin. Kết luận: S. saprophyticus.
Đo đường kính vòng vô khuẩn, nếu ≥ 16mm → vi khuẩn nhạy cảm novobiocin. Kết luận: Staphylococci không tiết men coagulase khác.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Vi khuẩn hình cầu khuẩn Gram dương, tụ lại thành chùm gây bệnh thường gặp là: A. S. aureus C. N. meningitidis
B. E. coli D. N. gonorrhoae
2. Vi khuẩn Gram dương, hình cầu, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau: A. Staphylococcus aureus C. E. coli
B. Streptococci faecalis D. gonorrhoae
3. Thử nghiệm phân biệt Staphylococci và Streptococci.
A. Catalase C. Mannitol
B. Coagulase D. Hemolysin
4.Thử nghiệm phân biệt S.aureus với Staphylococci khác
A. Catalase C. Mannitol
B. Coagulase D. Hemolysin
5. Kết quả thạch máu hồng cầu bị vi khuẩn ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết sáng,