2.1. Thử nghiệm Catalase
2.1.1. Mục đích
Thử nghiệm này giúp phân biệt tụ cầu - Staphylococci và liên cầu - Streptococci.
2.1.2. Nguyên tắc
Enzyme Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và khí oxy. Vi khuẩn tiết men catalase sẽ cho thử nghiệm dương tính.
2.1.3. Cách tiến hành
Nhỏ một giọt H2O2 (3%) lên trên lame kính sạch, dùng vòng cấy nhựa lấy một ít vi khuẩn mọc trên thạch Nutrion Agar cho vào giọt H2O2.
2.1.4. Đọc kết quả
Có hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn, ghi nhận Catalase dương tính. Kết luận là tụ cầu khuẩn - Staphylococci.
Nếu không có hiện tượng sủi bọt, ghi nhận catalase âm tính. Kết luận là liên cầu khuẩn
- Streptococci.
Lưu ý: Khi lấy vi khuẩn trên thạch máu nên lấy một ít ở phần trên của khóm vi khuẩn, tránh tiếp xúc với môi trường vì hồng cầu có khả năng làm thử nghiệm Catalase cho kết quả dương tính giả.
Hình 2.1. Thử nghiệm Catalase14
2.2. Thử nghiệm Mannitol
2.2.1. Mục đích
Thử nghiệm Mannitol để phân biệt S.aureus với Staphylococci khác (S.epidermidis).
2.2.2. Nguyên tắc
Trên môi trường chọn lọc Mannitol Salt Agar (MSA), S. aureus có khả năng lên men đường mannitol, axit hóa môi trường nên chỉ thị đỏ phenol chuyển sang vàng.
2.2.3. Cách tiến hành
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn S.aureus từ ống Nutrient Agar (NA), cấy zic-zac lên mặt thạch nghiêng ống MSA thứ nhất. Đốt tiệt trùng que cấy.
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn S.epidermidis từ ống NA, cấy zic-zac lên mặt thạch nghiêng ống MSA thứ hai. Đốt tiệt trùng que cấy.
Ủ cả 2 ống nghiệm vừa cấy ở 35oC/18-24 giờ.
2.2.4. Đọc kết quả:
Đĩa MSA 1 chuyển sang màu vàng → vi khuẩn S.aureus lên men đường mannitol. Đĩa MSA 2 vẫn giữ nguyên màu đỏ → S.epidermidis không lên men đường mannitol.
Hình 2.2. Thử nghiệm Mannitol15 Hình 2.3. Thử nghiệm Coagulase16
2.3. Thử nhiệm Coagulase
2.3.1. Mục đích
Thử nghiệm phân biệt S.aureus với các loài Staphylococci khác.
2.3.2. Nguyên tắc
Enzyme coagulase của vi khuẩn hiện diện dưới hai dạng là dạng liên kết (clumping factor) và dạng tự do (free coagulase). Enzyme này gây nên hiện tượng lợn cợn hoặc đông đặc huyết tương khi tiếp xúc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3. Cách tiến hành
- Trên lame: Tìm coagulase liên kết
Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame, lấy vài khóm vi khuẩn trộn với giọt nước cất để tạo huyền dịch vi khuẩn. Sau đó nhỏ một giọt huyết tương bên cạnh rồi trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Trong vòng 10 giây, xuất hiện những hạt lợn cợn, ghi nhận thử nghiệm coagulase dương tính.
Lưu ý:
Để lâu hơn 10 giây có thể xảy ra kết quả dương tính giả.
Thử nghiệm coagulase trên lame âm tính đều phải tiến hành tìm coagulase tự do.
- Trong ống nghiệm: Tìm coagulase tự do.
Lấy hai ống nghiệm có chứa 0,5 ml canh cấy S.aureus và S.epidermidis. Nhỏ lần lượt 0,5 ml huyết tương thỏ (pha loãng 1:5) vào hai ống nghiệm trên, trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Đem ủ cách thủy 37oC/4 giờ.
2.3.4. Đọc kết quả
Sau 1 - 4 giờ nếu có hiện tượng đông đặc huyết tương ghi nhận thử nghiệm coagulase dương tính. Kết luận S. aureus.
Lưu ý:
S. aureus: làm đông đặc huyết tương; S. epidermidis: không làm đông huyết tương.
Nếu sau 4 giờ huyết tương không đông phải ủ tiếp ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18 giờ. Có thể dùng huyết tương người nếu không có huyết tương thỏ.
2.4. Thử nghiệm ngưng tụ latex nhanh
2.4.1. Mục đích
Xác định hiện tượng ngưng kết hạt giữa kháng thể đặc hiệu khi gặp kháng nguyên tương ứng của vi khuẩn với sinh phẩm thử nghiệm.
2.4.2. Nguyên tắc
Những hạt nhựa latex dạng nano được phủ một lớp kháng thể đặc hiệu sẽ ngưng kết khi gặp kháng nguyên tương ứng. Staphytect Plus là bộ kit thử nhanh dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể, dùng để phát hiện đồng thời coagulase dạng liên kết (clumping factor), protein A, và polysaccharide của nang vi khuẩn Staphylococcus aureus.
2.4.3. Cách tiến hành
Trên tấm bìa, cho những hạt nhựa latex đã được phủ kháng thể đơn dòng đặc hiệu tiếp xúc với vi khuẩn Staphylococci. Lắc nhẹ tấm bìa 30 giây.
2.4.4. Đọc kết quả
Dương tính: trong vòng 20 giây, các hạt latex sẽ kết tụ khi gặp kháng nguyên tương ứng đặc hiệu → vi khuẩn là Staphylococcus aureus.
Âm tính: Không xảy ra hiện tượng ngưng kết, vi khuẩn là Staphylococci khác.
Lưu ý: Phản ứng dương tính giả có thể xuất hiện sau 40 giây.
2.5. Thử nghiệm tiêu huyết (HEMOLYSIN)
2.5.1. Mục đích
Xác định các kiểu tiêu huyết của vi khuẩn.
2.5.2. Nguyên tắc
Một số vi khuẩn như Staphylococci, Steptococci có khả năng tiết hemolysin làm ly giải hồng cầu tạo vòng tiêu huyết đục mờ hay trắng trong xung quanh khuẩn lạc.
2.5.3. Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn Staphylococci hoặc Steptococci từ ống NA cấy ria 3 chiều lên hộp thạch máu cừu. Đem ủ 37oC/18 - 24 giờ.
2.5.4. Đọc kết quả
Xung quanh khóm vi khuẩn mọc trên hộp thạch máu xuất hiện vòng sáng tiêu huyết do hồng cầu bị ly giải chứng tỏ vi khuẩn có tiết ra hemolysin. Có 3 kiểu tiêu huyết α, β, γ.
* Kiểu tiêu huyết α: trên môi trường thạch máu vi khuẩn ly giải không hoàn toàn hồng cầu tạo vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh màu xanh xung quanh khuẩn lạc.
* Kiểu tiêu huyết β: trên môi trường thạch máu vi khuẩn ly giải hoàn toàn hồng cầu tạo vòng tiêu huyết sáng, trong xung quanh khuẩn lạc.
* Kiểu tiêu huyết γ: trên môi trường thạch máu vi khuẩn không ly giải hồng cầu nên không tao vòng tiêu huyết.
Hình 2.4. Thử nghiệm tiêu huyết16
2.6. Thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin (TAXO A)
2.6.1. Mục đích
Phân biệt Streptococci tiêu huyết β nhóm A và Streptococci tiêu huyết β nhóm B.
2.6.2. Nguyên tắc
Streptococci tiêu huyết β nhóm A nhạy cảm với bacitracin. Thử nghiệm này phân biệt
Streptococci tiêu huyết β nhóm A với Streptococci tiêu huyết β thuộc B.
2.6.3. Cách tiến hành
Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt lên đó đĩa Taxo A là đĩa giấy tẩm 0,04 IU Bacitracin. Ủ 350C/18 - 24 giờ trong bình nến.
2.6.4. Đọc kết quả
- Xung quanh đĩa Taxo A có vòng vô khuẩn → thử nghiệm Taxo A dương tính. Kết luận là vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β, nhóm A (Streptococcus pyogenes).
- Ngược lại thì Taxo A âm tính, phải tiến hành tiếp theo thử nghiệm CAMP để xác định
Streptococci tiêu huyết β, nhóm B.
Hình 2.5. Thử nghiệm TAXO A17 Hình 2.6. Thử nghiệm CAMP18
2.7. Thử nghiệm CAMP (Christie, Atkins và Munch – Peterson)
2.7.1. Mục đích
Xác định vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β nhóm B.
2.7.2. Nguyên tắc
Streptococci tiêu huyết β nhóm B tiết ra một protein gọi là yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với β-lysin của S. aureus.
2.7.3. Cách tiến hành
Cấy một đường thẳng dòng vi khuẩn S. aureus có sinh β-lysin lên mặt thạch máu cừu. Sau đó vạch một đường cấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β thẳng góc với đường cấy S. aureus nhưng cách 1 - 2 mm.
Ủ 35oC/18 giờ hoặc 35oC/6 giờ trong bình nến.
2.7.4. Đọc kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điểm tiếp giáp 2 đường cấy vi khuẩn S. aureus và Streptococci tạo vùng tiêu huyết rộng và sáng hơn, có dạng hình cánh cung/vảy cá → thử nghiệm CAMP dương tính. Kết luận là vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β, nhóm B (S.agalactiae).
2.8. Thử nghiệm nhạy cảm Optochin (TAXO P)
2.8.1. Mục đích
Xác định vi khuẩn Streptococci tiêu huyết α nhóm B.
2.8.2. Nguyên tắc
S.pneumococci nhạy cảm với Optochin nên xung quanh đĩa Taxo P xuất hiện vòng vô khuẩn. Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn này để phân biệt S.pneumococci với các Streptococci
tiêu huyết α khác (ví dụ Streptococcus viridans).
17Nguồn: Chp.12 Biochemicals-Taxo A Test
2.8.3. Cách tiến hành
Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết α trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa Taxo P là đĩa giấy tẩm 5 µg Optochin. Ủ 35oC/18 giờ trong bình nến.
2.8.4. Đọc kết quả
Xung quanh đĩa Taxo P xuất hiện vòng vô khuẩn có đường kính ≥ 14 mm → thử nghiệm Optochin dương tính. Kết luận: cầu khuẩn này là S. pneumonia (Phế cầu khuẩn).
Lưu ý: Nếu đường kính vòng kháng khuẩn <14 mm cần tiến hành làm thử nghiệm tan trong muối mật để xác định Pneumococci.
Hình 2.6. Thử nghiệm TAXO P19
2.9. Thử nghiệm kháng Novobiocin
2.9.1. Mục đích
Dựa vào thử nghiệm này để phân biệt S.saprophyticus và Staphylococci không tiết coagulase khác.
2.9.2. Nguyên tắc
S. saprophyticus đề kháng tự nhiên với novobiocin, xác định đặc điểm này để khẳng định tính kháng novobiocin của vi khuẩn bằng đĩa giấy có tẩm 5 µg novobiocin.
2.9.3. Cách tiến hành
- Dùng que gòn trải đều vi khuẩn Staphylococci không tiết coagulase lên hộp thạch Muller-Hinton Agar (MHA).
- Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa giấy tẩm 5 µg novobiocin. - Ủ 35oC/18 - 24 giờ.
2.9.4. Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô khuẩn, nếu < 16mm → vi khuẩn đề kháng novobiocin. Kết luận: S. saprophyticus.
Đo đường kính vòng vô khuẩn, nếu ≥ 16mm → vi khuẩn nhạy cảm novobiocin. Kết luận: Staphylococci không tiết men coagulase khác.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Vi khuẩn hình cầu khuẩn Gram dương, tụ lại thành chùm gây bệnh thường gặp là: A. S. aureus C. N. meningitidis
B. E. coli D. N. gonorrhoae
2. Vi khuẩn Gram dương, hình cầu, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau: A. Staphylococcus aureus C. E. coli
B. Streptococci faecalis D. gonorrhoae (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Thử nghiệm phân biệt Staphylococci và Streptococci.
A. Catalase C. Mannitol
B. Coagulase D. Hemolysin
4.Thử nghiệm phân biệt S.aureus với Staphylococci khác
A. Catalase C. Mannitol
B. Coagulase D. Hemolysin
5. Kết quả thạch máu hồng cầu bị vi khuẩn ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết sáng, trong, bao quanh khuẩn lạc
A. Tiêu huyết α C. Tiêu huyết γ
B. Tiêu huyết β D. Tiêu huyết µ
6. Kết quả thạch máu hồng cầu bị vi khuẩn ly giải không hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh lên màu xanh.
A. Tiêu huyết α C. Tiêu huyết γ
B. Tiêu huyết β D. Tiêu huyết µ
8. Tiêu chí xác định Taxo P dương tính:
A. Đo đường kính vòng kháng khuẩn ≥ 14 mm B. Đo đường kính vòng kháng khuẩn ≤ 14 mm C. Thấy xuất hiện vòng kháng khuẩn đủ kết luận. D. Tất cả đúng
9. Kháng sinh dùng trong thử nghiệm Taxo A:
A. Optochin C. Ofloxacin
Bài 3
CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH TRỰC KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT
Mục tiêu học tập
Bài này giúp người đọc:
1. Phân biệt được vi khuẩn họ Enterobacteriaceae với trực khuẩn Gram âm khác.
2. Đọc và giải thích được các phản ứng sinh hóa cơ bản dùng định danh sơ bộ vi khuẩn.
A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT I. TÍNH CHẤT
Họ vi khuẩn đường ruột bao gồm những vi khuẩn tìm thấy trong ruột người và động vật, có ở trong đất và cây cối. Một số là ký sinh, số khác là hoại sinh. Vi khuẩn đường ruột có tính chất chung sau:
- Trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi.
- Đa số di động nhờ tiên mao (flagella) xung quanh thân, một số không có tiên mao nên không di động (Shigella, Klebsiella).
- Lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không). - Khử nitrate thành nitrite.
- Không tiết enzyme oxidase.
Những vi khuẩn đường ruột thường gây bệnh chuyên biệt cho người.
1.1. E. coli: gây tiêu chảy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- EPEC (enteropathogenicE. coli): chủ yếu gây bệnh ở trẻ em, cơ chế chưa rõ ràng. - ETEC (enterotoxigenic E . coli): gây bệnh do tiết độc tố ruột, loại dễ bị hủy bởi nhiệt
- EIEC (enteroinvasiveE. coli): gây bệnh do xâm lấn tế bào.
- EHEC (enterohemorrhagic E. coli): gây bệnh do tiết độc tố giống độc tố Shiga của
Shigella dysenteriae nên còn được gọi là STEC.
- EAEC (enteroadherentE. coli): có khả năng bám dính bề mặt niêm mạc ruột.
1.2. Shigella: Gây bệnh lỵ, trực khuẩn, có bốn nhóm
Nhóm A: S.dysenteriae, tiết độc tố Shiga.
Nhóm B: S.flexneri, tiết độc tố giống độc tố Shiga (Shiga-like toxin). Nhóm C: S.boydii không tiết độc tố.
Nhóm D: S.sonnei, tiết độc tố giống độc tố Shiga.
1.3. Salmonella
Đã biết trên 2.200 týp huyết thanh khác nhau dựa vào công thức kháng nguyên O, H và K. Hiện nay, căn cứ vào DNA, người ta chia Salmonella làm hai loài: Salmonella enterica và
Salmonella bongori.
Salmonella enterica có 6 phụ loài (subspecies). Phụ loài I, còn gọi là Salmonella enterica
subsp. enterica, có 3 tác nhân gây bệnh quan trọng:
- Salmonellaenterica subsp. enterica serotype typhi: gây sốt thương hàn.
- Salmonella enterica subsp. enterica serotype choleraesuis: gây nhiễm khuẩn huyết và áp xe khu trú ở các cơ quan nội tạng.
- Salmonella enterica subsp. enterica serotype paratyphi: gây sốt phó thương hàn.
II. CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUỐI CẤY VI KHUẨN 2.1. Môi trường vận chuyển
Dùng để chuyên chở bệnh phẩm, chứa muối đệm với rất ít chất dinh dưỡng để vi khuẩn sống nhưng không phát triển, loại thường dùng là Cary-Blair.
2.2. Môi trường tăng sinh
Là loại môi trường chứa dinh dưỡng đủ cần thiết cho các vi khuẩn có thể sinh trưởng, thường chứa nguồn cabon như Glucose hoặc Succinate, một vài loại muối Magie, Nitrogen, Phosphor, Sulfur là nguyên liệu để vi khuẩn tổng hợp protein và axit nucleic.
Gồm các môi trường: Canh dinh dưỡng (Nutrient Broth), thạch dinh dưỡng (NA), thạch máu (BA) hoặc BHI (Brain Heart Infusion) tạo thuận lợi tăng sinh hầu hết các loại vi khuẩn, môi trường Selenite tăng sinh Salmonella.
2.3. Môi trường phân lập
* Môi trường phân biệt
Là loại môi trường nuôi cấy vi sinh dùng để phân biệt 2 hoặc nhiều loại vi khuẩn cùng sinh trưởng trên 1 môi trường dựa vào tính chất hóa sinh của sinh vật khi phát triển sẽ tạo nên màu hoặc dấu hiệu nhận biết đặc trưng.
Ví dụ:
- Thạch Blood agar chứa máu tim bò sẽ trong suốt nếu có sự xuất hiện của
Streptococcus.
- Thạch Eosin methylene blue dùng cho phân biệt sự lên men lactose. - Mannitol agar dùng phân biệt lên men mannitol.
* Môi trường chọn lọc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Là loại môi trường chứa chất chuyên biệt, sử dụng cho một loại vi sinh vật nhất định phát triển, ức chế sự phát triển của các vi kuẩn khác.
Ví dụ:
- Thạch MC (Mac Conkey) chứa crystal violet, thạch EMB (Eosin Methylene Blue) chứa Eosin Y: ức chế vi khuẩn Gram dương.
- Thạch SS (Salmonella - Shigella) chứa muối mật và Brilliant Green: ức chế vi khuẩn Gram dương và hiện tượng mọc lan của Proteus.
- Thạch Bismuth Sulfite chứa Bismuth Sulfite, Brilliant Green: ức chế vi khuẩn Gram dương, dùng để phân lập Salmonella, nhất là Salmonella typhi trong nước, thực phẩm và bệnh phẩm.
2.4. Môi trường định danh
Dùng để xác định tính chất sinh hóa của vi khuẩn. Một số thường được sử dụng gồm: KIA (Kligler’s Iron Agar), TSI (Triple Sugar Iron Agar), SIM, Urea, MR - VP, Citrate, các loại đường (Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose,...), các amino axit (Lysine, Arginine, Ornithine, phenylalanine), ONPG (o-nitrophenyl β-D-galacto-pyranoside),...
Trong chẩn đoán xác định vi sinh, người ta dùng những phản ứng sinh hóa cơ bản gọi là “short key” để chẩn đoán sàng lọc sơ bộ. Các phản ứng cơ bản gồm:
- Lên men đường: glucose, lactose, sucrose, maltose, dulcitol,…
- IMViC: phản ứng indol, phản ứng MR (methyl red), phản ứng VP (Voges - Proskauer), phản ứng citrate.
- Ngoài ra, có thể khảo sát thêm tính di động, khử nitrate, tiết urease, phản ứng ONPG, phenylalanine deaminase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, arginine dihydrolase.
Hiện nay trên thị trường có những bộ kit thương mại API- 10S, API- 20E test strip được sử dụng rộng rãi để định danh vi khuẩn đường ruột, tiện dụng cho kết quả nhanh và chính xác.
III. CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT 3.1. Thử nghiệm oxidase
3.1.1. Mục đích
Phát hiện vi sinh vật tiết ra enzyme oxidase (hệ cytochrom C), nhằm mục đích phân biệt vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn gram âm khác.
3.1.2. Nguyên tắc
Thử nghiệm oxidase được sử dụng để xác định vi khuẩn sinh cytochrome oxidase là enzyme của chuỗi vận chuyển điện tử vi khuẩn. Sự hiện diện của enzyme oxidase (Cytochrome Oxidase System) oxy hóa thuốc thử Tetramethyl-p-phenylenediamine trong điều kiện oxygen khí trời tạo thành indophenol sản phẩm có màu tím.
3.1.3. Cách tiến hành
Dùng que cấy nhựa, lấy một ít vi khuẩn, trải lên đĩa giấy oxidase (đĩa giấy có tẩm chất dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%).
3.1.4. Đọc kết quả
Dương tính: đĩa giấy có màu xanh đậm đến tím đen trong vòng 10-20 giây.