Phối hợp kháng sinh

2.1. Mục đích phối hợp kháng sinh

- Tăng hiệu quả diệt khuẩn: các kháng sinh khi được phối hợp có thể diệt các chủng vi khuẩn đã đề kháng với các kháng sinh riêng lẻ.

- Mở rộng phổ kháng khuẩn: trong trường hợp nhiễm trùng cấp nặng, chưa xác định được tác nhân gây bệnh, vi khuẩn chưa kịp định danh, bác sĩ lâm sàng dùng kháng sinh phối hợp để mở rộng hoạt phổ kháng khuẩn nhằm đảm bảo kháng sinh diệt được với bất kỳ vi khuẩn nào.

- Ngăn ngừa vi khuẩn kháng với các loại kháng sinh: có một số kháng sinh dễ bị kháng nên không dùng riêng. Hoặc trong trường hợp phải sử dụng kháng sinh dài ngày cũng có nguy cơ tạo các chủng vi khuẩn đề kháng cao.

2.2. Kết quả của sự phối hợp kháng sinh

- Hợp lực: các kháng sinh phối hợp giúp tác động kháng khuẩn mạnh hơn các kháng sinh dùng riêng lẻ trên một loại vi khuẩn. Đây là phối hợp có lợi.

- Riêng lẻ: phối hợp có tác động như các kháng sinh dùng riêng lẻ. Có thể chấp nhận để mở rộng hoạt phổ kháng khuẩn.

- Đối kháng: tác động của phối hợp thấp hơn mỗi kháng sinh dùng riêng. Cần tránh các trường hợp này. A B ^{A B A B} A + B _{A + B} ^{A + B} Hình 4.3. Phối hợp kháng sinh

III. XÁC ĐỊNH MIC VÀ MBC

MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.

MBC (Minimal Bactericidal Concentration) là nồng độ kháng sinh tối thiểu diệt khuẩn.

3.2. Nguyên tắc * Xác định MIC

Pha loãng kháng sinh theo tỷ lệ 1/2 liên tục trong môi trường lỏng. Cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Ủ ở 370C/24 giờ. Hết thời gian ủ quan sát độ đục bằng mắt thường, từ đó xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn.

* Xác định MBC

Để tìm MBC, dãy nồng độ bắt đầu sẽ cao hơn trong xác định MIC (theo dõi sau 24 giờ ủ hoặc sau từng 2 giờ ủ), từ đó xác định nồng độ kháng sinh tương ứng thấp nhất mà số lượng vi khuẩn chỉ còn lại 0,01 % so với lượng vi khuẩn ban đầu. Nồng độ này chính là nồng độ kháng sinh tối thiểu diệt khuẩn (MBC).

3.3. Tiến hành

3.3.1. Môi trường Muller – Hinton

Pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất. Nếu làm môi trường rắn thêm vào 18 g thạch/1.000 ml môi trường.

3.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách lấy 3-5 khóm vi khuẩn cấy trên 5 ml canh thang Mueller - Hinton ủ ở 37 oC /2-6 giờ, sau đó pha loãng với nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) sao cho độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 0,5 (tương đương 1-3 x 108 vi khuẩn/ml) hoặc có thể sử dụng máy quang phổ kế đo ở bước sóng 625 nm (độ hấp thu OD trong khoảng 0,08 – 0,1 tương đương với ống McFarland 0,5)

- Tiến hành thử nghiệm pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ khoảng 1-3 x 107 vi khuẩn/ml. - Chủng vi khuẩn sử dụng: E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC 25923; P. aeruginosa

ATCC 27853.

3.3.3. Chuẩn bị kháng sinh

Kháng sinh được cân chính xác và pha dung dịch mẹ có nồng độ gấp 10 lần nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ. Dung dịch mẹ bảo quản lạnh trước khi sử dụng.

Cách pha: Lọ kháng sinh Vancomycin 500 mg

Pha với 100 ml nước cất vô trùng, được dd nồng độ 5 ml/1ml Cách tính: CV = C’V’

5mg x V = 0,16mg x 10ml V = 0,16.10/5 =0.32 ml

Lấy 0,32ml dung dịch Vancomycin 5mg/ml thêm 9,68ml nước cất, ta được dung dịch Vancomycin có nồng độ 160µg/ml.

3.3.4. Các bước tiến hành

Pha loãng 10 lần dung dịch kháng sinh mẹ từ nồng độ 160 µg/ml thành 16 µg/ml. Thực hiện dãy nồng độ kháng sinh theo bảng sau:

Bảng 4.1. Bảng dãy nồng độ kháng sinh

Ống thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 7

Lượng kháng sinh (DD mẹ)/ml 1 ^Chứng _dương ^Chứng _âm

Lượng môi trường (ml) 9 5 5 5 5 5 5

Nồng độ kháng sinh (µg/ml) 16 8 4 2 1 0 0

Lượng vi khuẩn (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0

Sự tăng trưởng vi khuẩn sau 24h - - - + + + -

6 5 4 7 5 ml Bỏ 5 ml Chứng + Chứng -

3.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách lấy 3-5 khóm vi khuẩn cấy trên 5 ml canh thang Mueller - Hinton ủ ở 37 oC /2-6 giờ, sau đó pha loãng với nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) sao cho độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 0,5 (tương đương 1-3 x 108 vi khuẩn/ml) hoặc có thể sử dụng máy quang phổ kế đo ở bước sóng 625 nm (độ hấp thu OD trong khoảng 0,08 – 0,1 tương đương với ống McFarland 0,5)

- Tiến hành thử nghiệm pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ khoảng 1-3 x 107 vi khuẩn/ml. - Chủng vi khuẩn sử dụng: E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC 25923; P. aeruginosa

ATCC 27853.

3.3.3. Chuẩn bị kháng sinh

Kháng sinh được cân chính xác và pha dung dịch mẹ có nồng độ gấp 10 lần nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ. Dung dịch mẹ bảo quản lạnh trước khi sử dụng.

Cách pha: Lọ kháng sinh Vancomycin 500 mg

Pha với 100 ml nước cất vô trùng, được dd nồng độ 5 ml/1ml Cách tính: CV = C’V’

5mg x V = 0,16mg x 10ml V = 0,16.10/5 =0.32 ml

Lấy 0,32ml dung dịch Vancomycin 5mg/ml thêm 9,68ml nước cất, ta được dung dịch Vancomycin có nồng độ 160µg/ml.

3.3.4. Các bước tiến hành

Pha loãng 10 lần dung dịch kháng sinh mẹ từ nồng độ 160 µg/ml thành 16 µg/ml. Thực hiện dãy nồng độ kháng sinh theo bảng sau:

Bảng 4.1. Bảng dãy nồng độ kháng sinh

Ống thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 7

Lượng kháng sinh (DD mẹ)/ml 1 ^Chứng _dương ^Chứng _âm

Lượng môi trường (ml) 9 5 5 5 5 5 5

Nồng độ kháng sinh (µg/ml) 16 8 4 2 1 0 0

Lượng vi khuẩn (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0

Sự tăng trưởng vi khuẩn sau 24h - - - + + + -

6 5 4 7 5 ml Bỏ 5 ml Chứng + Chứng - 1 2 3 4 5 ₆ 1 7 1 ml Kháng sinh 5 ml ^{5 ml 5 ml 5 ml Bỏ 5 ml} Chứng + Chứng - 1 5 ml 9 ml

Hình 4.33. Cách pha dãy nồng độ kháng sinh

Cấy vi khuẩn: Tất cả các ống đều được cấy cùng với một lượng vi khuẩn là 0,25 ml huyền trọc vi khuẩn có mật độ 1-3x 107 vi khuẩn/ml để cuối cùng mật độ vi khuẩn trong ống khoảng 5.105 vi khuẩn/ml.

(Cách tính: CV = C’V’ = 107x V = 5.105 x 5ml V = 5.5.105/107 = 0.25 ml)

Quan sát và ghi nhận kết quả:

- Lắc nhẹ các ống trước khi quan sát.

- Quan sát kết quả của chứng âm và chứng dương xem có phù hợp hay không (chứng âm trong, chứng dương đục).

- Quan sát các ống nghiệm từ nồng độ thấp đến cao, xác định ống đầu tiên có hiện tượng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, nghĩa là ống trong nằm cạnh sát ống đục, tương ứng với nồng độ kháng sinh đã pha loãng. Đây chính là ống có MIC.

Hình 4.4. Kết quả thự nghiệm MIC

Vậy trong thử nghiệm này MIC là ống số (3) tương ứng với nồng độ kháng sinh là 4 µg/ ml. Các ống (1) và (2) cũng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn nhưng không phải là nồng độ kháng sinh thấp nhất.

Những điều cần lưu ý

- Xác định MIC là một thử nghiệm định lượng nên việc tính toán nồng độ kháng sinh, lượng vi khuẩn phải chính xác.

- Vi khuẩn phải thuần khiết trước khi đưa vào thử nghiệm.

- Môi trường và dung môi không chứa bất kỳ chất gì ảnh hưởng đến tác động của kháng sinh và sự phát triển của vi khuẩn.

- Thao tác nhanh chóng và tránh nhiễm chéo từ bên ngoài.

- Phải luôn có chứng âm và chứng dương để kiểm soát quá trình thao tác. - Phải có bộ MIC chuẩn để đối chiếu kết quả.

Bảng 4.2. Bảng biện giải kháng sinh đồ

Kháng sinh kháng sinh/^{Hàm lượng} đĩa (µg)

Biện giải theo đường kính vùng ức chế (mm) Đề kháng

(R) trung gian (I)^{Nhạy cảm Nhạy cảm} (S)

Penicillin G 10UI Staphylococcus spp ≤ 28 - ≥ 29 Enterococcus spp 10UI ≤ 14 - ≥ 15 (d) Amoxicillin và Ampicillin Trực khuẩn Gram+ và Enterobacteria ^{10UI ≤ 13 14-16 ≥ 17} Staphylococcus spp 10UI ≤ 28 - ≥ 29 Enterococcus spp 10UI ≤ 6 7 -16 ≥ 17

Amoxicillin /clavulanic axit 20/10

Enterobacteriaceae, Non enterobacteriace- ae ^{≤ 13 14-17 ≥ 18} Staphylococcus spp ≤ 19 - ≥ 20 Bacitracin 10UI ≤ 8 9 - 12 ≥ 12 Cephalexin 30 ≤ 14 15-16 ≥ 18 (a) Cephalothin 30 ≤ 14 15 -17 ≥ 18 Cefoxitin (Cn) 30 ≤ 14 15 -17 ≥ 18 Amikacin (Ak) 30 ≤ 14 15-16 ≥ 17 Imipenem (Im) 10 ≤ 19 20 - 22 ≥ 23 Ceftriaxon (Cx) 30 ≤ 13 14-20 ≥ 21

Kháng sinh kháng sinh/^{Hàm lượng} đĩa (µg)

Biện giải theo đường kính vùng ức chế (mm) Đề kháng

(R) trung gian (I)^{Nhạy cảm Nhạy cảm} (S)

Trimetoprim/Sulfamethoxazol (Bt) ^23,75/ 1,25 ^{≤ 10 11-15 ≥ 16} Chloramphenicol 30 ≤ 12 13-17 ≥ 18 Colistin 10 ≤ 8 9 -10 ≥ 11 Erythromycin 15 ≤ 13 14-22 ≥ 23 Azithromycin 14 ≤ 13 14-17 ≥ 18 Gentamicin (a) 10 ≤ 12 13-14 ≥ 15

Bảng 4.3. Bảng biện giải kháng sinh đồ

Kháng sinh kháng sinh/đĩa ^{Hàm lượng} (µg)

Biện giải theo đường kính vùng ức chế

Đề kháng

(R) trung gian (I)^{Nhạy cảm Nhạy cảm} (S)

Kanamycin 0 ≤ 13 14 -17 ≥ 18

Streptomycin 10 ≤ 11 12 -14 ≥ 15

Methicillin 5 ≤ 9 10 -13 ≥ 14

Nafcillin

và Oxacillin(a) 1 ≤ 10 11 -12 ≥ 13

Nalidixic axit (a) 30 ≤ 13 14 -18 ≥ 19

Ciprofloxacin 5 ≤ 15 16 - 20 ≥ 21 Norfloxacin 10 ≤ 12 13 -16 ≥ 17 Ofloxacin 5 ≤ 12 13 -15 ≥ 16 Neomycin 30 ≤ 12 13 -16 ≥ 17 Novobiocin(a) 30 ≤ 17 18 -21 ≥ 22 Oleandomycin 15 ≤ 11 12 -16 ≥ 17 Nitrofurantoin (b) 300 ≤ 14 15 -16 ≥ 17 Polymycin B 300 ≤ 8 9 -11 ≥ 12 Sulfonamid (b,e) 300 ≤ 12 13 -16 ≥ 17 Tetracyclin 30 ≤ 14 15 -18 ≥ 19 Doxycyclin 30 ≤ 12 13 -15 ≥ 16 Vancomycin 30 ≤ 9 10 -11 ≥ 12 Lincomycin 2 ≤ 9 10 -14 ≥ 15

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1. MIC là

A. Nồng độ kháng sinh tối đa ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn B. Nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn C. Nồng độ kháng sinh tối đa diệt khuẩn

D. Nồng độ kháng sinh tối thiểu diệt khuẩn 2. MBC là

A. Nồng độ kháng sinh tối đa ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn B. Nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn C. Nồng độ kháng sinh tối đa diệt khuẩn

D. Nồng độ kháng sinh tối thiểu diệt khuẩn

3. Để phát hiện các Enterococci kháng Vancomycin thì nhiệt độ thích hợp là A. 300C/24 giờ.

B. 370C/24 giờ C. 300C/4-6 giờ D. 370C/4-6 giờ

4. Môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ là

A. Thạch Mueller - Hinton B. Canh thang Mueller - Hinton C. Canh thang Tryptic Soy Broth D. Mannitol Salt Agar

5. Thông tin cần có để tra bảng biện giải kháng sinh đồ

A. Kháng sinh, vi khuẩn B. Hàm lượng hoạt lực đĩa kháng sinh C. Đường kính vùng ức chế D. Tất cả đều đúng

6. Mục đích phối hợp kháng sinh A. Tăng hiệu quả diệt khuẩn B. Mở rộng phổ kháng khuẩn

C. Ngăn ngừa vi khuẩn kháng kháng sinh D. Tất cả đều đúng

B

ài 5

KIỂM TRA VI SINH MẪU NƯỚC

Mục tiêu học tập

Bài này giúp người đọc:

1. Trình bày nguyên tắc kiểm nghiệm vi sinh trong mẫu nước.

2. Trình bày phương pháp định lượng Coliforms tổng số xác định E. coli,và đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí.

3. Tiến hành định lượng Coliforms tổng số xác định E. coli, , và đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu nước.

I. ĐẠI CƯƠNG

Hệ vi khuẩn trong nước rất phong phú đa số là các vi khuẩn hoại sinh, là một bộ phận của dây chuyền sinh thái có khả năng phân hủy chất bẩn trong nước do đó chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc làm giảm mức ô nhiễm nguồn nước. Tuy nhiên sự hiện diện số lượng vi khuẩn quá lớn hay khi có mặt các vi khuẩn gây bệnh chứng tỏ nguồn nước bị nhiễm bẩn.

Sự nhiễm bẩn của nước có thể xảy ra tại nguồn hay ở nơi nào đó trong hệ thống ống dẫn đồng thời cũng có thể xảy ra ở khâu cuối cùng trong quá trình xử lý và khử khuẩn không phù hợp.

Phân loại nước:

- Nước hợp vệ sinh: trong, không màu, không mùi, không vị, không chứa các chất độc hại và vi khuẩn gây bệnh cho người. Đạt yêu cầu chất lượng về vật lý, hóa học và sinh học.

- Nước sạch: có chất lượng cao hơn nước hợp vệ sinh

- Nước bi ô nhiễm: bị nhiễm một số chỉ tiêu vật lý (mùi, màu..), chất hóa học (sắt, nitrate, nitrit…), sinh học (vi khuẩn…).

Nước là nhu cầu chủ yếu không thể thiếu của cuộc sống sinh hoạt hàng ngày của con người, là nguồn dự trữ mầm bệnh đồng thời cũng là tác nhân trung gian truyền bệnh như: thương

hàn, phó thương hàn, lỵ, viêm dạ dày ruột, bệnh tả … và đã có các đại dịch lớn liên quan đến nguồn nước bị ô nhiễm. Do vậy việc kiểm tra chất lượng nguồn nước là rất cần thiết. Để phản ánh đúng đắn tình hình vệ sinh nguồn nước, số lượng mẫu nước kiểm nghiệm phải đủ đại diện, vì vậy việc lấy mẫu - bảo quản và vận chuyển đến phòng thử nghiệm phải theo đúng quy định chung về phương pháp lấy mẫu nước của Bộ Y Tế.

S.feacalis

C.perfringens

Salmonela E.coli

P.aeruginosa V.cholerae

Hình 5.1. Các vi khuẩn thường gặp trong nước

II. NGUYÊN TẮC

Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí để đánh giá mức độ ô nhiễm chung của nguồn nước. Phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn E. Coli và số lượng Coliforms trong nước để xác định nguồn nước sử dụng có bị nhiễm phân tươi hay không.

III. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU

Chai vô khuẩn, đèn khò gas để khử trùng, cồn 70o để khử khuẩn, kẹp, bông gòn, bút lông và biên bản lấy mẫu để ghi thông tin mẫu nước (tất cả để trong hộp nhôm hay nhựa). Thùng đá để bảo quản mẫu ở nhiệt độ lạnh (4 - 10oC) trong trường hợp lấy mẫu xà phòng thử nghiệm.

3.2. Rửa và sấy chai lọ

Rửa sạch chai lọ bằng xà phòng, sau đó ngâm trong dung dịch Sulfocromic trong 24 giờ. Rửa súc kỹ bằng nước sạch và tráng bằng nước cất. Đậy nút chai vừa khít, bọc giấy nhôm trên đầu nút và cổ chai. Sấy tiệt trùng 180oC trong 30 phút

3.3. Lấy mẫu

Mẫu được lấy vào chai đã tiệt trùng như trên.

Lấy mẫu đúng quy cách hướng dẫn tùy theo nguồn nước khảo sát:

- Lấy nước máy: tại nhà máy xử lý nước thì mẫu được lấy ở ống vào và ống ra của nhà máy. Tại trạm khử trùng thì mẫu được lấy từ đường vào và đường ra của trạm.

- Lấy nước từ vòi: đốt miệng vòi rồi cho nước chảy bỏ 5 phút rồi mới hứng lấy.

- Lấy nước bề mặt: sông, hồ, ao suối. Lấy cách bờ 5 - 10 m, úp chai xuống sâu khoảng 30 - 40 cm, xoay ngược chiều nước chảy để tránh nhiễm bẩn từ tay.

- Lấy nước ngầm: nước giếng đào, giếng đóng. Dùng chai có chì ở đáy, miệng chai có thể rút ra bằng cách giật dây.

- Điền đầy đủ thông tin vào phiếu lấy mẫu, lưu ý các yếu tố ngoại cảnh khi lấy mẫu.

3.4. Bảo quản vận chuyển mẫu

Nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng nhiều đến sự tăng, giảm số lượng vi khuẩn của mẫu nước. Nếu không bảo quản đúng yêu cầu sẽ đưa đến kết quả không chính xác.Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi về phòng thử nghiệm không quá 24 giờ. Trong trường hợp lấy mẫu quá xa, yêu cầu bảo quản mẫu trong điều kiện lạnh 4 - 10oC và phân tích trong vòng 6 giờ đối với nước thô và 12 giờ đối với nước đã xử lý.

IV. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH MẪU NƯỚC