4.1. Định lượng Coliforms tổng cộng
Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Số lượng Coliforms
được dùng để chỉ thị mức độ ô nhiễm phân tươi trong mẫu nước. Vì thế Coliforms còn được gọi là vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh - chỉ thị cho biết mức độ an toàn vệ sinh của môi trường, nước hay một sản phẩm. Coliforms gồm 04 giống: Citrobacter,Klebsiella, Enterobacter và
Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli.
4.1.1. Định nghĩa
4.1.1.1. Coliforms tổng số
Coliforms tổng số thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae), là những trực khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, lên men đường lactose ở 37oC
trong vòng 24 giờ, sinh hơi do có men β-galactosidase. Oxydase âm tính.
4.1.1.2. Coliforms chịu nhiệt
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC.
4.1.1.3. E. coli giả định/ Coliforms phân
E. coli giả định(Coliforms phân hay Coliformsfaecal) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton.
4.1.14. E. coli
E. coli có tính chất giống Coliforms phân và cho kết quả thử nghiệm IMViC: + + - -
E. coli là tác nhân chính trong rất nhiều trường hợp tiêu chảy, nhất là tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi. Coliforms tổng cộng Coliforms chịu nhiệt E.coli giả định E. coli E.coli giả định E. coli
Coliforms chịu nhiệt
Coliforms tổng cộng
Hình 5.2. Sự liên quan giữa Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E. coli giả định và E. coli
4.1.2. Nguyên tắc chung
- Cấy lượng mẫu thử xác định đã pha loãng hoặc không pha loãng vào dãy ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có Lactose.
- Ủ ở nhiệt độ 35oC hoặc 37oC/24-48 giờ. Hết thời gian ủ kiểm tra và ghi nhận các ống nghiệm đục có sinh khí khẳng định sự có mặt của Coliforms. Cấy chuyển tiếp từ mỗi ống nghiệm đục có sinh khí sang môi trường chọn lọc EMB để tìm E. Coli.
- Từ số các ống nghiệm cho kết quả dương tính, dựa vào bảng chỉ số MPN (Most Probable Number) và các giới hạn tin cậy để xác định số lượng Coliforms tổng số có trong 100 ml mẫu thử.
MPN là phương pháp số đếm có xác suất gần đúng nhất, còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn. Phương pháp này giúp đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng của nó có xác suất lớn nhất có mặt trong một đơn vị thể tích mẫu hay nói cách khác phương pháp này dựa trên nguyên tắc xác suất cao nhất sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Độ chính xác của phương pháp này phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn.
4.1.3. Dụng cụ
- Tủ sấy tiệt trùng.
- Nồi hấp tiệt trùng (autoclave). - Tủ ấm 30 ± 1oC, 35 ± 1oC, 37 ± 1oC.
- Ống nghiệm 16 mm x 160 mm, 20 mm x 200 mm. - Đĩa petri, pipette khắc độ 1 ml, 10 ml.
- Que cấy và đèn cồn.
4.1.4. Cách tiến hành
4.1.4.1. Định lượng Coliforms tổng số (TCVN 6187-2: 2020 phương pháp nhiếu ống)
Cấy mẫu nước vào môi trường theo từng lô, nhiều dãy, mỗi dãy 3 ống chứa môi trường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
BGLB (Bile Green Lactose Broth) chọn lọc có chuông Durham:
- Cấy 10 ml mẫu vào 3 ống nghiệm chứa 10 ml BGBL nồng độ kép (dãy 1). - Cấy 1 ml mẫu vào 3 ống nghiệm chứa 9 ml BGBL nồng độ đơn (dãy 2).
- Thực hiện tương tự với các nồng độ pha loãng kế tiếp 10-1, 10-2… (dãy 3, 4…). - Ủ các ống này ở 37 ± 1oC / 24 ± 2 giờ đến 48 ± 2 giờ.
* Ghi nhận ống BGBL dương tính
- Sau thời gian ủ, ghi nhận tất cả các ống nghiệm BGBL dương tính ở mỗi dãy nồng độ pha loãng: đục và sinh khí trong chuông Durham.
- Chọn ống BGBL dương tính ở 3 dãy nồng độ pha loãng liên tục.
- Từ những ống nghiệm BGBL dương tính ứng với mỗi nồng độ pha loãng ghi nhận được, tra vào bảng MPN có được chỉ số MPN và tính kết quả.
* Cách tính kết quả
Dựa vào công thức: N = x
MPN 100 V t× ×
Trong đó:
- N: là số lượng Coliforms tổng cộng trong 100 ml mẫu thử nghiệm.
- tx: là nồng độ pha loãng của mẫu thử (nồng độ đậm đặc nhất trong dãy 3 nồng độ pha loãng liên tiếp được chọn để tính kết quả).
- V: là thể tích mẫu thử nghiệm (ở nồng độ đậm đặc nhất trong dãy 3 nồng độ pha loãng liên tiếp được chọn để tính kết quả).
Ví dụ 1: Sau khi ủ ghi nhận được thông tin:
Ống môi trường BGBL nồng độ kép 100 (10ml) --- 3 ống (+)
Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 100 (1ml) --- 2 ống (+)
Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 10-1 (1ml) --- 1 ống (+)
Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 10-2 (1ml) --- 0 ống (+) Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 10-3 (1ml) --- 0 ống (+) Ta được số ống dương tính là 3, 2, 1 và trị số MPN là 15 với V = 10ml, tx = 100
Theo công thức trên → N = = = 15
Vậy kết quả số lượng Coliforms tổng cộng là: 1,5 x 101MPN /100 ml.
Ví dụ 2: Sau khi ủ ghi nhận được thông tin:
Ống môi trường BGBL nồng độ kép 100 (10ml) --- 3 ống (+) Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 100 (1ml) --- 3 ống (+)
Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 10-1 (1ml) --- 2 ống (+)
Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 10-2 (1ml) --- 1 ống (+)
Ống môi trường BGBL nồng độ đơn 10-3 (1ml) --- 0 ống (+) Ta được số ống dương tính là 3 2 1 và trị số MPN là 15
với V= 1ml, tx = 100
Theo công thức trên → N = x
MPN 100
V t× × = 15 0 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 10× × = 150
Vậy kết quả số lượng Coliforms tổng cộng là : 1,5 x 102MPN /100 ml.
4.1.4.2. Định tính E. coli (TCVN 6187-2: 2020 phương pháp nhiếu ống)
Thử nghiệm này thực hiện để kiểm tra xác định số lượng E. coli có trong mẫu nước.
- Từ những ống nghiệm môi trường BGBL nồng độ kép và nồng độ đơn có sinh khí (Mục 4.1.4.1).
- Cấy ria mỗi ống môi trường BGBL đục có sinh khí sang đĩa môi trường EMB.
- Ủ 24 giờ ở 35 - 37oC. Hết thời gian ủ quan sát những khuẩn lạc điển hình trên EMB có màu tím than ánh kim.
- Chọn khuẩn lạc màu tím than ánh kim trên EMB cấy đồng thời sang các ống nghiệm môi trường Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrat để xác định tính chất sinh hóa và khẳng định E. coli theo kết quả:
Bảng 5.6. Kết quả thử nghiệm IMViC xác địnhE. coli
VI KHUẨN Indol MR VP Citrat
E. coli + +
Klebsiella + +
Hình 5.3. Kết quả thử nghiệm IMViC
4.2. Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí (theo TCVN 4884-1:2015)
4.2.1. Định nghĩa vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ từ 30 - 37oC trong điều kiện hiếu khí trên môi trường dinh dưỡng bình thường.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện cho ta biết được mức độ nhiễm khuẩn của nguồn nước.
4.2.2. Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
4.2.2.1. Nguyên tắc
Mẫu thử nghiệm được pha loãng bằng nước vô trùng để là giảm dần mật độ vi khuẩn. Cấy một lượng nước thử nghiệm vào ít nhất 2 hộp petri trống. Sau đó đổ thạch PCA, lắc đều chờ thạch động đặc và đem ủ trong điều kiện hiếu khí. Hết thời gian ủ, xuất hiện các vi khuẩn trên các đĩa thạch. Ở độ pha loãng thích hợp sẽ có mật độ khác nhau, phân bố rời rạc trong đĩa thạch và tạo thành một khóm khuẩn lạc. Đếm tất cả những khuẩn lạc hiện diện trên 2 hộp petri và tính toán kết quả sẽ biết được số vi khuẩn trong mẫu thử.
4.2.2.2. Các bước thực hiện
Bước 1: Pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3... (sử dụng pipet riêng cho từng độ pha loãng).
Bước 2: Lấy 1 ml nước ở mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri (mỗi độ pha loãng 02 hộp).
Bước 3: Đun thạch PCA để nguội (45oC) ở nhiệt độ phòng sau đó đổ vào hộp petri. Lắc xoay tròn đều hộp để trộn vi khuẩn với thạch (lắc qua 10 vòng, lắc lại 10 vòng). Để thạch
nguội và đặc lại.
Bước 4: Ủ ở 37oC/24 - 48 giờ
Bước 5: Hết thời gian ủ, vi khuẩn sẽ xuất hiện trên mặt thạch.
* Chú ý: thời gian từ lúc cấy mẫu nước vào hộp petri đến lúc đổ thạch PCA vào không quá 15 phút.
Đếm tất cả các khuẩn lạc vi khuẩn xuất hiện trên mặt thạch (chọn những hộp petri có số khuẩn lạc 15 < x < 300). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2.2.3. Cách tính kết quả
* Trường hợp số lượng vi khuẩn nhiều x >15 khuẩn lạc trên đĩa thạch
Tính kết quả theo công thức: ( 1 2)
C N n 0,1 n d = +∑ × Trong đó:
- N là số khuẩn lạc có trong 1 g hoặc trong 1 ml mẫu.
- Σc là tổng số khuẩn lạc được đếm trên các đĩa được chọn. - n1 là số đĩa thực hiện cấy mẫu ở độ pha loãng thứ nhất (2 đĩa). - n2 là số đĩa thực hiện cấy mẫu ở độ pha loãng kế tiếp (2 đĩa).
- d là hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được chọn để đếm thỏa điều kiện 15 < x < 300.
Chú ý: Kết quả được làm tròn số và biểu thị với 2 số có nghĩa trong khoảng từ 1,0 đến 9,9 10n (n là số bậc lũy thừa cơ số 10).
Ví dụ: Ở nồng độ pha loãng (10-1) đếm được: 184 và 122 khuẩn lạc. Ở nồng độ pha loãng (10-2) đếm được: 20 và 26 khuẩn lạc.
Theo công thức ta có: ( ) 1 1 2 C 184 123 20 26 N n 0,1 n d (2 0,1 2) 10− + + + = = +∑ × + × × = 1600 ≈ 1.600
Kết quả: Tổng số vi sinh vật hiếu khí là: 1,6 x 103 khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml mẫu thử.
* Trường hợp số lượng vi khuẩn ít x < 15 khuẩn lạc trên đĩa thạch
Trong đó:
- N là số khuẩn lạc có trong 1 g hoặc trong 1 ml mẫu.
- C là trung bình cộng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn ở nồng độ d. - d là hệ số pha loãng của mẫu thử:
+ d = 100 đối với mẫu thử ở dạng lỏng thỏa điều kiện x < 15 + d = 10-1 đối với mẫu thử ở dạng rắn thỏa điều kiện x < 15
Ví dụ 1:
Ở nồng độ pha loãng (100) đếm được: 14 và 12 khuẩn lạc (mẫu thử ở dạng lỏng). Theo công thức ta có: N C (14 12) / 20
d 10
+
= ∑ = = 13 khuẩn lạc/ml
Ví dụ 2:
Ở nồng độ pha loãng (10-1) đếm được: 14 và 12 khuẩn lạc (mẫu thử ở dạng rắn). Theo công thức ta có: N C (14 12) / 21
d 10−
+
= ∑ = = 130 khuẩn lạc/g
Ghi chú: Đối với ở dạng lỏng có độ sánh cao (mẫu siro) được xem là chế phẩm ở dạng đặc biệt, nên áp dụng công thức tính kết quả như chế phẩm ở dạng rắn, do đó kết quả được tính bằng khuẩn lạc/g (CFU/g).
Hình 5.4. Quy trình tạo hộp đổ để đếm số khuẩn lạc
4.3.Phương pháp màng lọc
Phương pháp này dùng một lượng nước lớn nên cho kết quả nhanh và chính xác hơn phương đổ đĩa và phương pháp đếm ống (MPN). Tuy nhiên đối với các mẫu nước có nhiều chất tủa lơ lững hoặc chất sánh có độ nhớt cao (mẫu sirô, dầu...) thì không áp dụng phương pháp này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kích thước lỗ lọc 0,45 µm, đường kính 47 mm sẽ giữ vi khuẩn lại trên màng lọc. Đặt màng lọc lên môi trường nuôi cấy (Chromocult coliform agar), ủ 37oC trong 18 - 24 giờ. Nếu có Coliforms, trên môi trường sẽ có những khuẩn lạc đặc biệt có màu đỏ và E. coli sẽ cho khuẩn lạc có màu xanh đậm.
Hình 5.5. Phương pháp màng lọc28
Tóm tắt quy trình định lượng Coliforms phương pháp đếm nhiều ống
Pha loãng mẫu thử lần lượt 100, 10-1, 10-2, 10-3
Chuyển 10ml 100 vào 3 ống 10 ml BGBL (kép)
Chuyển 10ml 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml BGBL (đơn) mỗi nồng có 3 ống lặp lại. Ủ ở 370C/48 giờ.
Ghi nhận các ống BGBL (+) (sinh hơi trong chuông Durham) ở mỗi nồng độ pha loãng
Tra bảng MPN và tính kết quả theo công thức
Kết luận: Số lượng Coliforms tổng số là …… MPN / 100ml mẫu thử
Bảng 5.7. Chỉ số MPN và và giới hạn tin cậy cho phép thử 3 ống nghiệm Kết quả số ống dương tính Chỉ số MP- N/100mL
Cấp hạng khi số mẫu được thử Giới hạn tin cậy
1 2 3 5 10 95% 95% 99% 99% 0 0 0 <0,30 0,00 0,94 0,00 1,40 0 0 1 0,30 3 2 2 2 1 0,01 0,95 0,00 1,40 0 1 0 0,30 2 1 1 1 1 0,01 1,00 0,00 1,60 0 1 1 0,61 0 3 3 3 3 0,12 1,70 0,05 2,50 0 2 0 0,62 3 2 2 2 1 0,12 1,70 0,05 2,50 0 3 0 0,94 0 0 0 0 3 0,35 3,50 0,18 4,60 1 0 0 0,36 1 1 1 1 1 0,02 1,70 0,01 2,50 1 0 1 0,72 2 2 1 1 1 0,12 1,70 0,05 2,50 1 0 2 1,1 0 0 0 3 3 0,4 3,5 0,2 4,6 1 1 0 0,74 1 1 1 1 1 0,13 2,00 0,06 2,70 1 1 1 1,1 3 3 2 2 2 0,4 3,5 0,2 4,6 1 2 0 1,1 2 2 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6 1 2 1 1,5 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2 1 3 0 1,6 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2 2 0 0 0,92 1 1 1 1 1 0,15 3,50 0,07 4,60 2 0 1 1,4 2 1 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6 2 0 2 2,0 0 3 3 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2 2 1 0 1,5 1 1 1 1 1 0,4 3,8 0,2 5,2 2 1 1 2,0 2 2 1 1 1 0,5 3,8 0,2 5,2 2 1 2 2,7 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2 0 2,1 1 1 1 1 1 0,5 4,0 0,2 5,6 2 2 1 2,8 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2 2 3,5 0 0 0 0 3 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3 0 2,9 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3 1 3,6 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2 3 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,5 9,4 0,3 14,2 3 0 1 3,8 1 1 1 1 1 0,9 10,4 0,5 15,7 3 0 2 6,4 3 3 2 2 2 1,6 18,1 1,0 25,0 3 1 0 4,3 1 1 1 1 1 0,9 18,1 0,5 25,0 3 1 1 7,5 1 1 1 1 1 1,7 19,9 1,1 27,0 3 1 2 12 3 2 2 2 1 3 36 2 44 3 1 3 16 0 0 0 3 3 3 38 2 52 3 2 0 9,3 1 1 1 1 1 1,8 36,0 1,2 43,0 3 2 1 15 1 1 1 1 1 3 38 2 52 3 2 2 21 2 1 1 1 1 3 40 2 56 3 2 3 29 3 3 3 2 2 9 99 5 152
Kết quả số ống dương tính Chỉ số MP- N/100mL
Cấp hạng khi số mẫu được thử Giới hạn tin cậy
1 2 3 5 10 95% 95% 99% 99%
3 3 0 24 1 1 1 1 1 4 99 3 152
3 3 1 46 1 1 1 1 1 9 198 5 283
3 3 2 110 1 1 1 1 1 20 400 10 570
3 3 3 >110
MỘT SỐ QUY CHUẨN QUỐC GIA ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC
QCVN01-1:2018/BYT: Chất lượng nước sạch dùng cho mục đích sinh hoạt Bảng 5.8. Chỉ tiêu, giới hạn chất lượng và phương pháp thử nước dùng cho sinh hoạt
Chỉ tiêu Đơn vị tính cho phépGiới hạn Phương pháp thử
Coliformstổng số MPN/ 100 ml < 3 TCVN 6187-2:2020
E. coli MPN/ 100 ml < 1 TCVN 6187-2:2020
S. aureus MPN/100 ml < 1 TCVN 11039-6:2015
P.aeruginosa MPN/ 100 ml < 1 TCVN 8881:2011
TCVN 6-1:2010/BYT: áp dụng cho nước đóng chai, nước khoáng thiên nhiên đóng chai Bảng 5.9. Chỉ tiêu, giới hạn chất lượng và phương pháp thử nước đóng chai
Chỉ tiêu Đơn vị tính cho phépGiới hạn Phương pháp thử
Coliforms tổng số MPN/250 ml 0 TCVN 6187-2:2020
E. coli MPN/250 ml 0 TCVN 6187-2:2020 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Streptococcus faecalis MPN/250 ml 0 TCVN 6189 - 2: 2009
Pseudononas aeruginosa MPN/250 ml 0 TCVN 8881:2011
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí để đánh giá A. Nguồn nước sử dụng có bị nhiễm phân tươi B. Nước bị nhiểm 1 số chỉ tiêu vật lý
C. Nước bị nhiễm chất hóa học
D. Mức độ ô nhiễm chung của nguồn nước 2. Coliforms gồm 04 giống
A. Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter và Escherichia
B. Staphylococci, Klebsiella, Enterobacter và Escherichia
C. Staphylococci, Streptococci, Enterobacter và Escherichia
D. Nesseria, Klebsiella, Enterobacter và Escherichia
3. Đặc điểm của Coliforms tổng số:
A. Trực khuẩn đường ruột, Gram âm, lên men đường lactose sinh hơi, phát triển ở 37oC. B. Trực khuẩn đường ruột, Gram âm lên men lactose trong khoảng 24 giờ
C. Trực khuẩn đường ruột, Gram âm, có khả năng sinh indole D. Trực khuẩn đường ruột, Gram âm, Oxydase dương tính