4.1. Yêu cầu chung khi cấy và phân lập vi khuẩn
- Luôn luôn thao tác trong điều kiện vô trùng.
- Phải đốt tiệt trùng que cấy platin trước khi lấy vi khuẩn.
- Hơ tiệt trùng không khí miệng ống nghiệm sau khi mở và trước khi đóng nắp ống nghiệm lại.
- Que cấy, đĩa petri và miệng ống nghiệm phải để trong vùng an toàn của ngọn lửa (cách xung quanh đường kính ngọn lửa ≤ 20 cm). Không để đĩa petri, ống nghiệm ngay trên ngọn lửa trong quá trình thao tác cấy phân lập, định danh vi khuẩn.
- Phải đốt tiệt trùng que cấy sau khi thao tác xong.
4.2. Phương pháp cấy chuyển vi khuẩn
Chuyển một loại vi khuẩn nhất định đang sống từ môi trường nuôi hoặc giống gốc sang môi trường mới thích hợp để các vi khuẩn này tiếp tục được nhân lên. Thao tác này còn được gọi là cấy chuyển nhằm mục đích để thu hoạch số lượng lớn vi khuẩn hoặc để khảo sát hình thái và tính chất sinh lý, sinh hóa của chúng.
4.2.1. Cấy chuyển trên môi trường lỏng
Cấy chuyển vi sinh vật từ ống nghiệm môi trường lỏng này sang ống nghiệm môi trường lỏng khác. Các bước thực hiện:
- Tay phải cầm que cấy, đốt tiệt trùng trên ngọn lửa đèn gas/cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy.
- Tay trái cầm ống giống, dùng ngón áp út và ngón út của tay phải mở nắp ống nghiệm ra (Chú ý: nút ống nghiệm được giữ chặt trên tay phải).
- Hơ qua ngọn lửa đèn gas/cồn để khử trùng không khí miệng ống nghiệm.
- Dùng que cấy đã đốt tiệt trùng vừa để nguội, khéo léo lấy một vòng dây cấy vi khuẩn từ ống giống, rút dây cấy ra (không để dây cấy chạm vào thành ống nghiệm), hơ miệng ống giống và đóng nắp lại. Đặt ống giống vào giá đỡ để ống nghiệm.
- Tay trái lấy ống môi trường (thao tác tiệt trùng làm tương tự như ống giống).
- Chuyển que cấy đã lấy vi khuẩn sang ống môi trường và hòa nhẹ nhàng vào canh cấy. - Cấy mẫu xong hơ miệng ống môi trường và đóng nắp lại. Đốt que cấy để hoàn tất
thao tác.
- Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
* Ghi chú: Có thể dùng pipette Pasteur để thay cho que cấy và thực hiện qui trình thao tác cấy chuyển giống như trên.
Mở nắp và hơ tiệt trùng miệng ống nghiệm
Đưa que cấy chứa vk
vào ống môi trường mới miệng ống môi trườngRút que cấy ra và hơ
Đóng nắp ống nghiệm Đốt tiệt trùng que cấyđể hoàn tất thao tác
Hình 1B.6. Cấy chuyển trên môi trường lỏng6
4.2.2. Cấy chuyển trên môi trường thạch
4.2.2.1. Cấy chuyển trên ống thạch nghiêng
- Tay phải cầm que cấy, tiệt trùng trên ngọn đèn gas/cồn đến khi nóng đỏ dây cấy. - Tay trái cầm ống giống, dùng ngón út và ngón áp út của tay phải kẹp nút ống nghiệm
và mở nút ra (Chú ý: nút ống nghiệm được giữ chặt trên tay phải). - Hơ nóng miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn gas/cồn để khử trùng.
- Dùng que cấy đã đốt tiệt trùng vừa để nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với sinh khối vi khuẩn trên mặt nghiêng môi trường ống giống, rút dây cấy ra (không để dây cấy chạm vào thành ống nghiệm), hơ miệng ống giống và đóng nắp lại. Đặt ống giống vào giá đỡ để ống nghiệm.
- Tay trái lấy ống môi trường thạch nghiêng mới (thao tác tiệt trùng làm tương tự như ống giống).
- Hòa giống ở đầu que cấy vào phần nước nhỏ ở đáy ống nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các cách: hình xoắn ốc, hình chữ chi, hình vạch ngang song song.
- Cấy mẫu xong hơ miệng ống nghiệm và đóng nút lại, đốt que cấy để hoàn tất thao tác. - Ủ nhiệt độ thích hợp.
Thạch nghiêng nuôi cấy vi khuẩn a. Thạch nghiêng chưa cấy vi khuẩn
b.c.d. Vi khuẩn mọc khác nhau trên thạch nghiêng
Hình 1B.7. Cấy chuyển trên ống nghiệm thạch nghiêng7
4.2.2.2. Cấy chuyển trên ống thạch đứng
- Sử dụng que cấy đầu nhọn. Thực hiện các thao tác vô trùng tương tự mục 4.2.2.1 - Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm thẳng sâu vào phần khối thạch
hình trụ không chạm đáy ống nghiệm (cách đáy ống nghiệm 0,5 cm). Thao tác phải nhẹ nhàng để không gây nứt hoặc bể thạch. Đốt que cấy để hoàn tất thao tác.
- Ủ nhiệt độ thích hợp.
Hình 1B.8. Cấy chuyển trên ống nghiệm thạch đứng8
* Ghi chú: Đối với môi trường KIA
- Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn, cấy ria trên mặt nghiêng trước rồi đâm sâu xuống phần thạch đứng, cách đáy ống nghiệm 0,5 cm.
- Hoặc có thể dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn để cấy ria trên mặt thạch nghiêng trước. Đốt que cấy. Rồi dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn đâm sâu xuống phần thạch đứng, cách đáy ống nghiệm 0,5 cm.
4.2.2.3. Cấy trên đĩa thạch
* Cấy ria
Nguyên tắc: Làm giảm dần lượng vi khuẩn để đến vùng thưa nhất tạo được khuẩn lạc riêng lẻ.
Mục đích: Tạo khuẩn lạc riêng lẻ thuần khiết để khảo sát tính chất sinh lý, sinh hóa định danh vi khuẩn.
Thực hiện:
Ghi thông tin trên đĩa thạch, chia hộp thạch thành 3 vùng A, B, C.
Bước 1:
- Tay phải cầm que cấy và đốt tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn/gas, chờ nguội, lấy một ít vi khuẩn.
- Tay trái cầm và mở hé nắp hộp thạch, bắt đầu thao tác cấy vi khuẩn ở vùng A theo đường zic- zac sát nhau và đường trước cách đường sau khoảng 1 - 2 mm. Trục dây cấy tạo với mặt thạch một góc khoảng 30o, mặt phẳng vòng dây cấy tiếp xúc song song với mặt thạch. Hết vùng A hơ nhẹ dây cấy để làm giảm bớt lượng vi khuẩn.
Bước 2:
- Xoay hộp thạch 90o,chuyểnvùng B sang vị trí A và cấy vi khuẩn ở vùng B theo đường zic- zac, sát nhau và đường trước cách đường sau khoảng 2 - 3 mm (bắt đầu cấy vùng
B phải kết nối với vùng A một đường). Hết vùng B hơ nhẹ dây cấy để làm giảm bớt lượng vi khuẩn.
Bước 3:
- Xoay hộp thạch 90o,chuyểnvùng C sang vị trí A và cấy vi khuẩn ở vùng C theo đường zic - zac, sát nhau và đường trước cách đường sau khoảng 3 - 4 mm (bắt đầu cấy vùng C phải kết nối với vùng B một đường). Hết vùng C đốt tiệt trùng que cấy hoàn tất thao tác.
- Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
Dây cấy tạo góc 30o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
với đường cấy Đốt que cấy
Hình 1B.9. Thao tác cấy ria trên đĩa thạch9
* Cấy trải
Ứng dụng kỹ thuật cấy trải để định lượng vi khuẩn trong mẫu thử và thử nghiệm kháng sinh đồ.
* Định lượng vi khuẩn trong mẫu thử
- Dùng micropipette hút 10 µl hoặc 100 µl lượng mẫu thử (tùy theo lượng vi sinh vật có trong mẫu thử) nhỏ lên bề mặt thạch.
- Dùng que trải thủy tinh đã tiệt trùng hoặc tiệt trùng trực tiếp bằng cách nhúng vào trong cồn và đốt trên ngọn lửa. Chờ que trải nguội (nếu đốt tiệt trùng trực tiếp trên ngọn lửa) và trải đều lượng mẫu thử lên khắp bề mặt môi trường đĩa thạch. Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Hết thời gian ủ đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên mặt thạch và tính kết quả, ghi nhận số lượng vi khuẩn có trong mẫu thử.
Hình 1B.10. Thao tác cấy trải trên hộp thạch10
* Thử nghiệm kháng sinh đồ
Thao tác cấy trải chi tiết xem ở bài thử nghiệm kháng sinh đồ
* Cấy đổ: ứng dụng để đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thử. - Ghi thông tin trên hộp lồng (đĩa petri)
- Dùng micropipette hút 10 µl, 100 µl hoặc 1.000 µl lượng mẫu thử (tùy theo lượng vi sinh vật có trong mẫu thử) cho vào hộp lồng trống.
- Đổ khoảng 15 ml môi trường thạch đã đun chảy và để nguội 45 - 47oC vào đĩa petri. - Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ để trộn đều mẫu thử với
môi trường thạch và để đông tự nhiên. - Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Hết thời gian ủ đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên mặt thạch và tính kết quả.
Hình 1B.11. Thao tác cấy đổ đĩa thạch11
10Nguồn: Microbilogy-Lab-Manual 2016
4.3. Phân lập và nhận dạng vi khuẩn trên đĩa thạch
Cấy ria, cấy trải hay cấy đổ đĩa sau thời gia ủ tạo thành khuẩn lạc riêng lẻ thuần khiết, chọn những khuẩn lạc này để xác định tính chất sinh lý, sinh hóa và định danh giống, loài vi khuẩn. Sử dụng kính hiển vi để quan sát hình dạng, kích thước, cách sắp xếp, cấu trúc của tế bào vi khuẩn sau khi nhuộm màu.
Một số đặc điểm vi khuẩn trên đĩa thạch như sau:
Màu sắc: Một số vi khuẩn tạo khuẩn lạc có màu đặc trưng: - Màu vàng: Staphylococcus aureus
- Vàng chanh: Sarcina lutea
- Trong như hạt sương: Streptococcus
- Sản sinh sắc tố xanh tiết ra môi trường: Pseudomonas aeruginosa
Hình dạng:
- Quan sát bìa khuẩn lạc: Tròn, đa giác, răng cưa, chia thùy.
- Quan sát chiều cao: bằng, cao - bằng, lồi thấp, lồi cao, lồi có chỏm.
Kích thước: nhỏ, to. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mùi: (đặt hộp cách xa 20 - 25 cm) vi khuẩn kỵ khí sinh H2S có mùi trứng thối.
Hình 1B.12. Một số đặc điểm hình dạng vi khuẩn trên đĩa thạch12
B. THỰC HÀNH
1. Quan sát sự di động của vi khuẩn E. coli bằng phương pháp giọt ép. 2. Quan sát và mô tả hình thái một số vi khuẩn nhuộm.
3. Nhuộm, quan sát vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và vẽ hình. 4. Thao tác cấy ria vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa.
5. Báo cáo kết quả thực tập.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Vật kính có độ phóng đại …... lần dùng để quan sát vi khuẩn di động.
2.Để quan sát vi khuẩn sau khi đã nhuộm màu, sử dụng vật kính có độ phóng đại …... lần dùng.
3. Ốc sơ cấp để…... 4. Ốc thứ cấp để…...… 5. Phẩm nhuộm được phân loại dựa vào:
A. Bản chất của ion mang màu
B. Tính chất vật lý của ion mang màu C. Tính chất hóa học của ion mang màu D. Khả năng hấp thụ của ion mang màu
6. Trong qui trình nhuộm Gram, giai đoạn nào là quan trong nhất: A. Giai đoạn tẩy cồn
B. Cố định vết bôi C. Chủng vi khuẩn D. Toàn bộ qui trình 7. Nguyên tắc nhuộm đơn
A. Methylene blue kiềm nhuộm được các hạt biến sắc của các trực khuẩn
B. Vi khuẩn bắt màu Gram âm do sự khác biệt của cấu trúc vách tế bào vi khuẩn C. Vi khuẩn bắt màu Gram dương do sự khác biệt của cấu trúc vách tế bào vi khuẩn D. Sự nhuộm màu sẽ dễ dàng với tác nhân nhuộm màu mạnh
8. Nguyên tắc nhuộm kép
A. Methylene blue kiềm nhuộm được các hạt biến sắc của các trực khuẩn
B. Vi khuẩn bắt màu Gram âm hoặc Gram dương do sự khác biệt của cấu trúc vách tế bào vi khuẩn
C. Sự nhuộm màu sẽ dễ dàng với tác nhân nhuộm màu mạnh D. Khó tẩy bởi các tác nhân tẩy mạnh như cồn pha axit loãng 9. Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương có màu:
A. Hồng C. Đỏ
B. Tím D. Cam
10. Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram âm có màu:
A. Hồng C. Đỏ
Bài 2
CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN Mục tiêu học tập
Bài này giúp người đọc:
1. Phân biệt được tụ cầu và liên cầu khuẩn.
2. Định danh S.aureus và Staphylococci coagulase (-). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Phân biệt được liên cầu nhóm A, liên cầu nhóm B và xác định phế cầu, S.pyogenes, S.agalactiea.
I. CẦU KHUẨN GRAM DƯƠNG GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP 1.1. Staphylococci (Tụ cầu khuẩn)
Vi thể: Staphylococci có hình cầu, đường kính ≈ 1 µm, bắt màu nhuộm Gram dương và tụ thành đám giống hình chùm nho.
Tăng trưởng:
- Mọc dễ dàng trên các môi trường thông thường như thạch dinh dưỡng (NA: Nutrient Agar), canh dinh dưỡng (NB: Nutrient Broth).
- Môi trường Mannitol Salt Agar (MSA) là môi trường chọn lọc dành cho Staphylococci
vì có chứa 7,5 - 9% NaCl. Ở môi trường nồng độ muối cao này ức chế sự phát triển các vi khuẩn khác chỉ có Staphylococci phát triển được.
Chi Staphylococci có ít nhất 30 loài, trong đó 4 loài rất hay gặp trên lâm sàng là: S. aureus,
S.epidermidis, S.haemolyticus, S.saprophyticus.
1.2. Streptococci (Liên cầu khuẩn)
- Vi thể: Streptococci hình cầu hay bầu dục, bắt màu nhuộm Gram dương, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau, vi khuẩn có thể đứng thành đôi một hoặc riêng lẻ, ít khi tụ thành đám.
- Tăng trưởng: Streptococci được nuôi trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng, ví dụ thạch máu cừu (BA: Blood Agar), thạch nâu (CA: Chocolate Agar), canh tim óc hầm
(BHI: Brain Heart Infusion), trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2. Trên thạch máu chúng tiêu huyết β, α, hoặc γ. Liên cầu nhóm D và Enterococci mọc được ở 6,5% NaCl.
* Streptococcus pneumoniae (Phế cầu khuẩn)
- Hình cầu, Gram dương, xếp thành đôi, hình mũi giáo, có thể xếp thành chuỗi ngắn. - Trên môi trường thạch máu gây tiêu huyết α. Dễ bị ly giải bởi các chất hoạt động bề
mặt như muối mật. Nhạy cảm với optochin (thử nghiệm Taxo P).
* Cầu khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp (Neisseria)
Vi thể: Neisseria thuộc họ Neisseriaceae, bắt màu nhuộm Gram âm, xếp thành đôi, hai mặt lõm quay vào nhau giống hình hạt cà phê.
Tăng trưởng: Mọc trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng như BA, CA, BHI, MTM (Modified Thayer - Martin) ở 35 - 37oC trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2.
Hai loài có vai trò quan trọng trong y học: N. meningitidis (Meningococcus - Não mô cầu) và N. gonorrhoae (Gonococcus - Lậu cầu). Dòng gây bệnh thường nằm bên trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính (nội bào).
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ định danh cầu khuẩn13
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ định danh nhóm Streptococci
II. CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN2.1. Thử nghiệm Catalase 2.1. Thử nghiệm Catalase
2.1.1. Mục đích
Thử nghiệm này giúp phân biệt tụ cầu - Staphylococci và liên cầu - Streptococci.
2.1.2. Nguyên tắc
Enzyme Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và khí oxy. Vi khuẩn tiết men catalase sẽ cho thử nghiệm dương tính.
2.1.3. Cách tiến hành
Nhỏ một giọt H2O2 (3%) lên trên lame kính sạch, dùng vòng cấy nhựa lấy một ít vi khuẩn mọc trên thạch Nutrion Agar cho vào giọt H2O2.
2.1.4. Đọc kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Có hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn, ghi nhận Catalase dương tính. Kết luận là tụ cầu khuẩn - Staphylococci.
Nếu không có hiện tượng sủi bọt, ghi nhận catalase âm tính. Kết luận là liên cầu khuẩn
- Streptococci.
Lưu ý: Khi lấy vi khuẩn trên thạch máu nên lấy một ít ở phần trên của khóm vi khuẩn, tránh tiếp xúc với môi trường vì hồng cầu có khả năng làm thử nghiệm Catalase cho kết quả dương tính giả.
Hình 2.1. Thử nghiệm Catalase14
2.2. Thử nghiệm Mannitol
2.2.1. Mục đích
Thử nghiệm Mannitol để phân biệt S.aureus với Staphylococci khác (S.epidermidis).
2.2.2. Nguyên tắc
Trên môi trường chọn lọc Mannitol Salt Agar (MSA), S. aureus có khả năng lên men đường mannitol, axit hóa môi trường nên chỉ thị đỏ phenol chuyển sang vàng.
2.2.3. Cách tiến hành
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn S.aureus từ ống Nutrient Agar (NA), cấy zic-zac lên mặt thạch nghiêng ống MSA thứ nhất. Đốt tiệt trùng que cấy.
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn S.epidermidis từ ống NA, cấy zic-zac lên mặt thạch nghiêng ống MSA thứ hai. Đốt tiệt trùng que cấy.
Ủ cả 2 ống nghiệm vừa cấy ở 35oC/18-24 giờ.
2.2.4. Đọc kết quả:
Đĩa MSA 1 chuyển sang màu vàng → vi khuẩn S.aureus lên men đường mannitol. Đĩa MSA 2 vẫn giữ nguyên màu đỏ → S.epidermidis không lên men đường mannitol.
Hình 2.2. Thử nghiệm Mannitol15 Hình 2.3. Thử nghiệm Coagulase16
2.3. Thử nhiệm Coagulase
2.3.1. Mục đích
Thử nghiệm phân biệt S.aureus với các loài Staphylococci khác.
2.3.2. Nguyên tắc
Enzyme coagulase của vi khuẩn hiện diện dưới hai dạng là dạng liên kết (clumping factor) và dạng tự do (free coagulase). Enzyme này gây nên hiện tượng lợn cợn hoặc đông đặc