Thử nghiệm MR

3.1. Nguyên tắc

Vi khuẩn sử dụng đường Glucose tạo ra tạo Axit pyruvic (axit bền) làm axit hóa môi trường do đó chỉ thị methyl red, chuyển từ màu đỏ sang vàng.

3.2. Tiến hành

Cấy vi khuẩn vào môi trường MR-VP ủ qua đêm, sau đó nhỏ vào khoảng 5 giọt dung dịch Methyl red.

3.3. Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Môi trường có màu đỏ. - Phản ứng âm tính: Giữ nguyên màu môi trường.

IV. THỬ NGHIỆM VP (VOGES – PROSKAUER)

Vi khuẩn sử dụng đường Glucose tạo ra tạo không bền (axit bền) làm axit hóa môi trường do đó chỉ thị methyl red, chuyển từ màu đỏ sang vàng.

Trong 1ml môi trường MR-VP đã cấy vi khuẩn, cho vào 0,6ml dung dịch A và 0,2ml dung dịch B, rồi lắc đều. Phản ứng dương tính (màu đỏ) sẽ xảy ra trong vòng 5 phút. Phản ứng âm tính giữ màu thuốc thử.

V. THỬ NGHIỆM TRÊN MÔI TRƯỜNG SIM (SULFUR INDOLE MOBILITY) 5.1. Thử nghiệm Sulfur (H2S)

Trong môi trường SIM vi khuẩn nào sản xuất H2S sẽ làm cho môi trường có màu đen

5.2. Thử nghiệm Indole

Nhỏ lên bề mặt môi trường SIM ít giọt thuốc thử Kovac’s, lắc nhẹ.

5.3. Thử nghiệm tính di động (Mobility)

Vi khuẩn nào có khả năng di động sẽ làm đục môi trường cấy.

Vi khuẩn nào không có khả năng di động, chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường kim cấy, môi trường xung quanh trong.

VI. THỬ NGHIỆM CITRAT

Phản ứng dương: môi trường có màu xanh dương (có vi khuẩn mọc). Phản ứng âm: môi trường có màu xanh lá cây (không có vi khuẩn mọc).

VII. THỬ NGHIỆM TRÊN MÔI TRƯỜNG KIA

Đối với vi khuẩn sử dụng glucose, không sử dụng lactose: ở phần thạch nghiêng có màu đỏ. Trái lại, ở phần thạch đứng mức có màu vàng.

Đối với vi khuẩn sử dụng glucose và lactose: cả hai phần thạch đứng và nghiêng đều màu vàng.

Pseudomonas và những vi khuẩn không sử dụng đường thì ống nghiệm KIA vẫn giữ nguyên màu của môi trường (màu đỏ phenol).

Vi khuẩn sử dụng glucose và sinh hơi thì hình thành bọt khí trong ống nghiệm, đôi khi thạch bị nứt.

Nếu vi khuẩn sinh H2S, trong KIA môi trường có màu đen.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1. Môi trường khảo sát sự lên men lactose:

A. Thạch Blood agar chứa máu tim bò B. Thạch Eosin methylene blue

C. Mannitol agar D. Thạch MH

2. Kết quả thử nghiệm quan sát trên môi trường SIM:

A. Di động, Indol, H2S B. Di động, VP, Citrat

C. Indol, H2S, VP D. Indol, Mannitol, Glucose

3. IMViC gồm

A. Phản ứng indol, phản ứng lên men đường, phản ứng VP, phản ứng citrate B. Tính di động, phản ứng MR, phản ứng VP, phản ứng citrate

C. Phản ứng indol, phản ứng MR, phản ứng VP, phản ứng citrate D. Tính di động, phản ứng MR, phản ứng VP, khử nitrate

4. Kết quả thử nghiệm oxidase dương tính

A. Đĩa giấy thử nghiệm có màu xanh tím trong vòng 10-20 giây B. Đĩa giấy thử nghiệm có màu đỏ trong vòng 10-20 giây

C. Đĩa giấy thử nghiệm có màu vàng trong vòng 10-20 giây D. Đĩa giấy thử nghiệm không đổi màu

5. Đọc kết quả thử nghiệm MR (Methyl Red) dương tính A. Ống nghiệm môi trường có màu đỏ

B. Ống nghiệm môi trường có màu xanh đậm C. Ống nghiệm môi trường có màu vàng D. Ống nghiệm môi trường có màu đen

6.Đọc kết quả thử nghiệm VP (Voges - Proskauer) dương tính A. Ống nghiệm môi trường có màu đỏ

B. Ống nghiệm môi trường có màu xanh đậm C. Ống nghiệm môi trường có màu vàng D. Ống nghiệm môi trường có màu đen

7. Đọc kết quả thử nghiệm Hydrogen Sulfite (H2S) dương tính A. Ống nghiệm môi trường có màu đỏ

B. Ống nghiệm môi trường có màu xanh đậm C. Ống nghiệm môi trường có màu vàng D. Ống nghiệm môi trường có màu tủa đen 8. Đọc kết quả thử nghiệm Indole dương tính

A. Ống nghiệm môi trường có màu vòng nhẫn màu đỏ B. Ống nghiệm môi trường có màu xanh đậm

C. Ống nghiệm môi trường có màu vàng D. Ống nghiệm môi trường có màu đen 9. Đọc kết quả thử nghiệm Citrate dương tính

A. Ống nghiệm môi trường có màu đỏ

B. Ống nghiệm môi trường có màu xanh dương C. Ống nghiệm môi trường có màu xanh lá cây D. Ống nghiệm môi trường có màu đen

Bài 4

CÁC THỬ NGHIỆM KHÁNG SINH Mục tiêu học tập

Bài này giúp người đọc:

1. Trình bày khái niệm MIC và MBC.

2. Thực hiện các kỹ thuật xác định MIC của kháng sinh.

3. Thực hiện các kỹ thuật xác định tính độ nhạy và tính kháng sinh của vi khuẩn.

A. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ KHÁNG SINH

Định nghĩa: Kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa được tạo thành bởi một nhóm các vi sinh vật, có tác dụng ức chế sự tăng trưởng hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.

Khái niệm chung về kháng sinh:

- Việc sử dụng kháng sinh dựa vào phổ kháng khuẩn tự nhiên của kháng sinh, tình trạng lâm sàng cũng như vị trí nhiễm trùng của bệnh nhân. Tuy nhiên do việc phân phối, sử dụng kháng sinh bừa bãi, bệnh nhân không tuân thủ đúng phát đồ do đó vi khuẩn đã đề kháng với kháng sinh và đưa đến nhiều thất bại trong điều trị.

- Việc xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh sẽ giúp bác sĩ đưa ra chỉ định sử dụng thuốc phù hợp và mang kết quả tốt trong điều trị. - Đối với các hợp chất kháng sinh mới phải thăm dò khả năng kháng khuẩn bằng cách

B. PHẦN THỰC HÀNH

I. THỬ NGHIỆM KHÁNG SINH ĐỒ

Mục đích của thử nghiệm kháng sinh đồ nhằm xác định mức độ nhạy và tính kháng với kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby - Bauer được sử dụng phổ biến để thực hiện thử nghiệm này. Kết quả thử nghiệm cho biết ngay độ nhạy hoặc tính kháng với kháng sinh của vi khuẩn. Thử nghiệm được thực hiện cùng một lúc với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Kết quả nhanh chóng giúp bác sĩ có định hướng chính xác, chỉ định sử dụng kháng sinh phù hợp, kịp thời đáp ứng được yêu cầu điều trị cho người bệnh.

1.1. Nguyên tắc

Đĩa giấy tẩm kháng sinh với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Xuất hiện đường kính vòng kháng khuẩn hay không, cho biết vi khuẩn còn nhạy đối với kháng sinh hay đã kháng với kháng sinh.

1.2. Vật liệu

1.2.1. Môi trường

Mueller - Hinton hoặc Trypticase Soy Agar hay môi trường thạch máu… Pha môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cho khoảng 25ml môi trường vào ống nghiệm (lượng này đủ để đổ vào hộp petri Ø 90 mm và cho bề dày của thạch là 4 mm).

Hấp tiệt trùng. Bảo quản trong các túi plastic và lưu giữ trong tủ lạnh, sử dụng trong vòng 30 ngày. Trước khi sử dụng phải lấy ra khỏi tủ lạnh và để ở nhiệt độ phòng.

1.2.2. Vi khuẩn thử nghiệm

Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách cấy vào canh thang Mueller - Hinton hay Tryptic Soy Broth. Ủ 37oC/4 - 6 giờ, sau đó pha loãng với NaCl 0,9% sao cho độ đục bằng thang McFarland 0,5 (1-3x108 vi khuẩn/ml).

1.2.3. Vi khuẩn kiểm chứng (chủng chuẩn)

Chủng vi khuẩn kiểm chứng chưa có biểu hiện kháng thuốc các loại kháng sinh đang sử dụng. Chủng chuẩn luôn được bảo quản dưới dạng lỏng hoặc đông khô ở âm 200C để hạn chế đột biến. Khi sử dụng phải hoạt hóa giống như chủng thử nghiệm.

1.2.4. Kháng sinh

Đĩa kháng sinh là những đĩa giấy có đường kính 6 mm được tẩm thuốc kháng sinh với nồng độ đã được tiêu chuẩn hóa xác định, hiện có bán sẵn trên thị trường. Các đĩa này phải được

đóng gói trong các ống có chứa chất chống ẩm, bảo quản ở ≤ -140C. Khi sử dụng, lấy ra để ở ngăn mát tủ lạnh nhiệt độ từ 2 - 80C/2 giờ rồi mới tiến hành thử nghiệm.

Trước mỗi lần sử dụng, các đĩa kháng sinh được kiểm tra hoạt lực trên vi khuẩn chuẩn.

1.3. Các bước tiến hành

Bước 1: Đun chảy môi trường MH, đổ vào đĩa hộp petri, để cho thạch đông lại.

Bước 2: Dùng que bông vô trùng thấm huyền trọc vi khuẩn, xoay nhẹ que trên thành ống để ép cho ráo nước, cấy trải trên mặt thạch thật đều và kín hết toàn bộ mặt thạch (đường cấy sau chồng lên đường cấy trước). Cuối cùng dùng que quét một vòng xung quanh sát thành hộp.

Bước 3: Chờ khô mặt thạch hoặc ủ ở 370C không quá 15 phút.

Bước 4: Đặt kháng sinh: dùng kẹp được tiệt khuẩn (hơ nhẹ trên đèn cồn và làm nguội) gắp các khoanh giấy đặt lên mặt thạch. Các đĩa kháng sinh đặt cách nhau tối thiểu 2,5 đến 3,5 cm và cách thành hộp 2 đến 2,5 cm. Chỉ được phép đặt đĩa kháng sinh khi mặt thạch đã khô và đảm bảo đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch.

Bước 5: Không xê dịch đĩa trong vòng 15 phút và úp ngược hộp thạch ủ ở 370C/24 giờ. Để phát hiện các Enterococci kháng Vancomycin thì nhiệt độ thích hợp là 300C/24 giờ.

Hình 4.1. Thao tác đặt đĩa kháng sinh

1.4. Quan sát và ghi kết quả

- Dùng thước kẻ có độ chia đến millimet hoặc thước chuyên dụng đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn.

- Tra vào bảng biện giải kháng sinh đồ có các thông tin: kháng sinh, vi khuẩn và hàm lượng hoạt lực đĩa kháng sinh, đường kính vùng ức chế tương ứng để suy ra độ nhạy hay kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh.

Hình 4.2. Kết quả kháng sinh đồ

Những điều cần lưu ý

- Thạch Mueller - Hinton là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ.

- Các đĩa kháng sinh cần bảo đảm hoạt lực với các vi khuẩn chuẩn: S.aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922…

- Cần có bảng tiêu chuẩn biện giải riêng biệt cho các vi khuẩn khó mọc như Haemophilus sp., Neisseria gonorrhoeae…

- Việc lựa chọn kháng sinh để thực hiện kháng sinh đồ tùy vào tác nhân gây bệnh. - Ghi chú cẩn thận vị trí các đĩa giấy tẩm các chất kháng sinh khác nhau để tránh nhầm

lẫn về kết quả khảo sát kháng sinh đồ.

II. PHỐI HỢP KHÁNG SINH

2.1. Mục đích phối hợp kháng sinh

- Tăng hiệu quả diệt khuẩn: các kháng sinh khi được phối hợp có thể diệt các chủng vi khuẩn đã đề kháng với các kháng sinh riêng lẻ.

- Mở rộng phổ kháng khuẩn: trong trường hợp nhiễm trùng cấp nặng, chưa xác định được tác nhân gây bệnh, vi khuẩn chưa kịp định danh, bác sĩ lâm sàng dùng kháng sinh phối hợp để mở rộng hoạt phổ kháng khuẩn nhằm đảm bảo kháng sinh diệt được với bất kỳ vi khuẩn nào.

- Ngăn ngừa vi khuẩn kháng với các loại kháng sinh: có một số kháng sinh dễ bị kháng nên không dùng riêng. Hoặc trong trường hợp phải sử dụng kháng sinh dài ngày cũng có nguy cơ tạo các chủng vi khuẩn đề kháng cao.

2.2. Kết quả của sự phối hợp kháng sinh

- Hợp lực: các kháng sinh phối hợp giúp tác động kháng khuẩn mạnh hơn các kháng sinh dùng riêng lẻ trên một loại vi khuẩn. Đây là phối hợp có lợi.

- Riêng lẻ: phối hợp có tác động như các kháng sinh dùng riêng lẻ. Có thể chấp nhận để mở rộng hoạt phổ kháng khuẩn.

- Đối kháng: tác động của phối hợp thấp hơn mỗi kháng sinh dùng riêng. Cần tránh các trường hợp này. A B A B A B A + B A + B A + B Hình 4.3. Phối hợp kháng sinh III. XÁC ĐỊNH MIC VÀ MBC 3.1. Định nghĩa

MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.

MBC (Minimal Bactericidal Concentration) là nồng độ kháng sinh tối thiểu diệt khuẩn.

3.2. Nguyên tắc * Xác định MIC

Pha loãng kháng sinh theo tỷ lệ 1/2 liên tục trong môi trường lỏng. Cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Ủ ở 370C/24 giờ. Hết thời gian ủ quan sát độ đục bằng mắt thường, từ đó xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn.

* Xác định MBC

Để tìm MBC, dãy nồng độ bắt đầu sẽ cao hơn trong xác định MIC (theo dõi sau 24 giờ ủ hoặc sau từng 2 giờ ủ), từ đó xác định nồng độ kháng sinh tương ứng thấp nhất mà số lượng vi khuẩn chỉ còn lại 0,01 % so với lượng vi khuẩn ban đầu. Nồng độ này chính là nồng độ kháng sinh tối thiểu diệt khuẩn (MBC).

3.3. Tiến hành

3.3.1. Môi trường Muller – Hinton

Pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất. Nếu làm môi trường rắn thêm vào 18 g thạch/1.000 ml môi trường.

3.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách lấy 3-5 khóm vi khuẩn cấy trên 5 ml canh thang Mueller - Hinton ủ ở 37 oC /2-6 giờ, sau đó pha loãng với nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) sao cho độ đục bằng với độ đục của ống McFarland 0,5 (tương đương 1-3 x 108 vi khuẩn/ml) hoặc có thể sử dụng máy quang phổ kế đo ở bước sóng 625 nm (độ hấp thu OD trong khoảng 0,08 – 0,1 tương đương với ống McFarland 0,5)

- Tiến hành thử nghiệm pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ khoảng 1-3 x 107 vi khuẩn/ml. - Chủng vi khuẩn sử dụng: E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC 25923; P. aeruginosa

ATCC 27853.

3.3.3. Chuẩn bị kháng sinh

Kháng sinh được cân chính xác và pha dung dịch mẹ có nồng độ gấp 10 lần nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ. Dung dịch mẹ bảo quản lạnh trước khi sử dụng.

Cách pha: Lọ kháng sinh Vancomycin 500 mg

Pha với 100 ml nước cất vô trùng, được dd nồng độ 5 ml/1ml Cách tính: CV = C’V’

5mg x V = 0,16mg x 10ml V = 0,16.10/5 =0.32 ml

Lấy 0,32ml dung dịch Vancomycin 5mg/ml thêm 9,68ml nước cất, ta được dung dịch Vancomycin có nồng độ 160µg/ml.

3.3.4. Các bước tiến hành

Pha loãng 10 lần dung dịch kháng sinh mẹ từ nồng độ 160 µg/ml thành 16 µg/ml. Thực hiện dãy nồng độ kháng sinh theo bảng sau:

Bảng 4.1. Bảng dãy nồng độ kháng sinh

Ống thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 7

Lượng kháng sinh (DD mẹ)/ml 1 Chứng dương Chứng âm

Lượng môi trường (ml) 9 5 5 5 5 5 5

Nồng độ kháng sinh (µg/ml) 16 8 4 2 1 0 0

Lượng vi khuẩn (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0

Sự tăng trưởng vi khuẩn sau 24h - - - + + + -

6 5 4 7 5 ml Bỏ 5 ml Chứng + Chứng -