3.1. Phương pháp định lượng
3.2. Phương pháp định tính
Thực hiện thử nghiệm để xác định có hay không có sự hiện diện của vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml chế phẩm.
Xác định Staphylococcus aureus
Cầu khuẩn Gram dương, thường tụ lại giống dạng chùm nho. Mọc dễ dàng trên hầu hết các môi trường cấy ở 37 ± 1oC. Trên môi trường thường cho khuẩn lạc lồi trơn, đường kính 1-4 mm, có khả năng tạo coagulase với huyết tương thỏ, tan huyết β. Tiết ra enzym protease, lecithinase thủy phân protein và lecithin có trong lòng đỏ trứng gà.
B. THỰC HÀNH
1. Xác định độ vô trùng của nước cất pha tiêm
Lấy 1ml chế phẩm vào 3 loại môi trường lỏng dưới đây và đem ủ:
- Môi trường Thioglycolate ở 35 - 37oC trong 14 ngày, kiểm tra vi khuẩn kỵ khí. - Môi trường Soybean - casein (BHI) ở 35 - 37oC trong 14 ngày, kiểm tra vi khuẩn
hiếu khí.
- Môi trường Sabouraud ở 20 - 25oC trong 14 ngày, kiểm tra nấm mốc nấm men. Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày thường xuyên quan sát các môi trường đã cấy. Hết thời gian ủ thấy môi trường vẫn trong, mẫu được xem là đạt tiêu chuẩn vô trùng vì vi khuẩn, nấm mốc, nấm men không phát triển trong môi trường nuôi cấy.
2. Xác định Staphylococcus aureus trong chế phẩm đông dược (sirô ho)
Cho 1 g chế phẩm cần thử nghiệm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương (BHI) ủ ở 30 - 35oC trong 18 đến 72 giờ, kiểm tra vi khuẩn phát triển trong môi trường.
- Nếu môi trường trong thì dừng thử nghiệm. Kết luận không phát hiện S. aureus trong mẫu thử.
- Nếu môi trường đục thì dùng que cấy chuyển lên đĩa thạch Baird - Parker (trong môi trường có nhũ dịch lòng đỏ trứng và tellurite Kali). Đậy nắp và lật ngược đĩa thạch, mang ủ ở 3o ± 5oC trong 18 đến 72 giờ. Sau thời gian ủ thấy xuất hiện những khuẩn lạc điển hình có đường kính 2 mm đến 5 mm có màu đen bóng (màu đen là do S. aureus có khả năng khử Tellurite Kali thành Tellurium) xung quanh có vòng đục và sáng (do S. aureus tiết ra men proteinase và lecithinase có khả năng thủy giải protein và lecithin trong lòng đỏ trứng trên môi trường Bair - Parker). Tiếp tục thử nghiệm phản ứng coagulase.
* Xác định coagulase trên lame với Kit Staph-Plus
- Nguyên tắc thử nghiệm: thử nghiệm ngưng kết hạt latex, phát hiện đồng thời kháng nguyên: fibrinogen, protein A và vỏ polysaccharide của S.aureus.
- Thành phần Kit Staphytect Plus: Fibrinogen, Protein A, kháng thể đa dòng đặc hiệu với nang polysaccharide. Hiện tượng ngưng kết sẽ xảy ra giữa kháng nguyên
S.aureus tương ứng với kháng thể trên hạt latex của bộ sinh phẩm (xem lại kit staphytect Plus).
- Cách thực hiện: nhỏ 1 giọt chứng âm và 1 giọt thuốc thử dương lên lam kính hoặc phiến giấy. Dùng que
cấy lấy một ít khuẩn lạc điển hình phết lên phần giọt chứng âm và trộn đều, tiếp theo lấy trên cùng khuẩn lạc phết lên phần giọt chứng dương và trộn đều.
- Quan sát và ghi nhận kết quả: có 3 trường hợp
+ Giọt chứng dương ngưng kết, giọt chứng âm không ngưng kết: Kết luận có sự hiện diện S.aureus.
+ Giọt chứng dương không ngưng kết, giọt chứng âm không ngưng kết: Kết luận không có sự hiện diện S.aureus.
+ Giọt chứng dương ngưng kết, giọt chứng âm ngưng kết: mẫu nhiễm tạp khuẩn, không kết luận và thực hiện lại.
Hình 6.2. Phân lập S.aureus từ mẫu siro ho
Hình 6.1. Khuẩn lạc S. aureus
Đánh giá chất lượng chế phẩm
Bảng 6.1. Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn của các chế phẩm được phẩm29
TT Loại chế phẩm Yêu cầu chất lượng CFU/ml (g)Đơn vị tính
1 Các chế phẩm dùng tại chỗ như chữa sưng tấy, tổn thương và các màng nhầy (mũi, họng, tai, âm đạo) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí - S. aureus - P. aeruginosa - Enterobacteria - Nấm, men/1g (ml). 1,0102 = 0 = 0 = 0 = 0
2 Các chế phẩm dùng tại chỗ cho da như kem bôi, nước thơm, dầu, dung dịch, bột. - Tổng số vi khuẩn hiếu khí - S. aureus - P. aeruginosa - Enterobacteria - Nấm, men/1g (ml). 5,0102 = 0 = 0 = 0 = 0
3 Các chế phẩm dùng uống, qua trực tràng, thấm qua da.
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí - Tổng số Enterobacteria
- Tổng số nấm không quá - Salmonella/10 g (ml)
- E. coli, S. aureus, P. aeruginosa
1,0104
5,0102
1,0102
= 0 = 0 4 Nước cất pha tiêm
- Vi khuẩn hiếu khí, - Vi khuẩn ky khí - Nấm men, nấm mốc Âm tính Âm tính Âm tính 5 ……….
Câu hỏi lượng giá:
1. Phân biệt sự khác và giống nhau giữa độ vô trùng và độ nhiễm khuẩn?
2. Dựa vào tiêu chí nào để xác định và đánh giá chất lượng độ vô trùng của mẫu dược phẩm? 3. Mô tả và giải thích hình dạng đặc trưng của vi khuẩn S.aureus xuất hiện trên môi trường Baird Parker?
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Y Tế (2012). Thực hành và quản lý phòng thí nghiệm. NXB Y học.
2. Bộ Y Tế (2017). Hướng dẫn thực hành kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Nxb Y học. 3. Bộ Y Tế (2018). Dược Điển Việt Nam, lần xuất bản thứ năm, phụ lục 13.7, trang PL
258 - PL 269.
4. Bô Y tế (2015), QĐ 26/QD-BYT/2013. Hướng dẫn Quy trình Kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh y học. NXB Y học.
5. Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y học, bộ môn Xét nghiệm (2017). Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh y học. NXB Y học.
6. Luật Phòng chống các bệnh truyền nhiễm số 03/2007/QH12 ngày 21/11/2007.
7. Nghị định số 92/2010/NĐ-CP ngày 30/8/2010. Chi tiết thi hành Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm về bảo đảm an toàn sinh học tại phòng thí nghiệm.
8. Nghị định số 103/2016/NĐ ngày 01 tháng 07 năm 2016. Quy định về bảo đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm.
9. Phạm Hùng Vân (2013). Kháng sinh - Đề kháng kháng sinh - KT kháng sinh đồ. NXB Y học.
10. Qui chuẩn Việt Nam QCVN 01-1:2018/BYT. Chất lượng nước sạch dùng cho mục đích sinh hoạt.
11. Quyết định số 43/2007/QĐ-BYT ngày 30/11/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế . Quy chế quản lý chất thải y tế.
12. Thông tư số 41/2018/TT-BYT, ngày 14 tháng 12 năm 2018. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia và quy định kiểm tra, giám sát chất lượng nước sạch sử dụng cho mục đích sinh hoạt.
13. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6191-2:1996 (ISO 6461/2:1986 (E)). Chất lượng nước - Phát hiện và đếm số bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphit.
14. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6187-2:2009. Định lượng Coliforms - Phương pháp nhiều ống (MPN)
15. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6-1:2010/BYT. Chất lượng nước đóng chai, nước khoáng thiên nhiên đóng chai. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8881:2011 (ISO 16266:2006). Chất lượng nước - Phát hiện và đếm Pseudomonas aeruginosa.
17. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO 15189: 2014. Phòng thí nghiệm Y tế - Yêu cầu về chất lượng và năng lực.
18. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013), Phần 1: Đếm khuẩn lạc ở 30°C bằng kỹ thuật đổ đĩa;
19. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 11039-6:2015. Phần 6: Phát hiện và định lượng S.aureus
bằng kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn nhất (MPN).
20. Thông tư số 40/2018/TT-BYT ngày 07 tháng 12 năm 2018. Quy định về quản lý mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm.
21. Thông tư liên tịch số 58/2015/TTLT – BYT – BTNMT quy định về quản lý chất thải y tế. 22. Trần Linh Thước (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước và thực phẩm.
NXB Giáo dục.
23. Trần Thanh Thuỷ (1998). Hướng dẫn thực hành Vi sinh học. NXB Giáo dục
Tiếng Anh
1. Alfred E. Brown anf all. Benson’s Microbiological Applications. Laboratory Manual in General Microbiology. Fourteenth Edition.
2. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Eighth Edition.
3. CLSI (2016). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 26th edition. M100S
4. ISO/TS 11133 - 1:2009 and ISO/TS 11133 - 2:2003 - Guidelines on preparation and production of culture media.
5. ISO 7218: 2007/AMD 1:2013. Microbiologie des aliments - Exigences et recommadation - Amendement 2013.
6. Microbiology: A Laboratoiry Manual. Eleventh Edition. 7. Merck Microbiology Manual 12 th Edition, 2016.
8. LAB-REF-02: Exigences pour l’accréditation des laboratoires selon la norme NF EN ISO/IEC 17025:2017.
PHẦN PHỤ LỤC
CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY - ĐỊNH DANH VI KHUẨN 1. Nutrient Agar (NA)
Enzymatic Digest of Gelatin 5 g
Beef Extract 3 g
Agar 15 g
Nước cất vừa đủ 1.000ml
Hòa tan các thành phần trên (23 g) vào trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH = 6,8 ở 25oC. Phân 10ml môi trường vào các ống nghiệm 16mm x160mm. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 ± 1oC/15 phút.
2. Mueller Hinton Agar (MHA)
Beef Extract 2 g
Axit Hydrolysate of Casein 17,5g
Starch 1,5 g
Agar 17 g
Nước cất 1.000 ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hòa tan 37,5 g thành phần trên trong lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH 7,3 ± 0,2. Phân vào các chai 100 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC/15 phút. Sau khi tiệt trùng xong để nguội 47oC đổ đĩa petri. Bảo quản tủ lạnh 4oC.
3. Canh thang Bain Heart Infusion (BHI)
Peptone pepsique de viande 10,0 g
Extrait de cervelle 12,5 g Extrait de cœur 5,0 g Glucose 2,0 g NaCl 2,0 g Hydrogenophosphate disodique 2,5 g Nước cất 1.000 ml
Hòa tan các thành phần trên vào trong 1 lít nước, đun nhẹ và khuấy cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25oC. Phân 10ml các ống nghiệm 16mm x 160mm, hấp tiệt trùng ở 121oC ± 10C /15 phút. Bảo quản nhiệt độ lạnh 4oC.
4. Mannitol Salt Agar (MSA)
Enzymatic digest of casein 5,0 g
Enzymatic digest of animal tissue 5,0 g
Beef extract 1,0 g D-mannitol 10,0 g Sodium chloride 7,5 g Phenol red 0,025 g Agar-agar 15 g Nước 1.000 ml
Hòa tan các thành phần trên trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH 7,4 ± 0,2. Phân vào các chai 100 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC/15 phút. Sau khi tiệt trùng xong để nguội 47oC đổ đĩa petri. Bảo quản tủ lạnh 4oC.
5. Môi trường BAIRD- PARKER (BP)
Peptone 10,0 g
Extrait de levure 1,0 g
Extrait de viande boeuf 5,0 g
Chlorure de lithium 5,0 g
Glycine 12,0 g
Sodium pyruvate 10,0 g
Agar-agar 20,0 g
Nước cất
* Pha môi trường cơ bản
Hòa tan các thành phần trên vào trong nước, đun nhẹ và khuấy cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH = 7,2 ± 0,2 ở 25oC. Phân 90 ml vào chai, hấp tiệt trùng ở 121 ± 1oC /15 phút.
* Cách pha nhũ dịch lòng đỏ trứng (1/4)
- Trứng tươi, ngâm vào ly cồn 70o trong 3 phút
- Lấy ra, dùng kéo vô trùng khoét một lổ nhỏ sao cho bỏ được hết phần lòng trắng của trứng, chuyển phần lòng đỏ trứng vào ly có mỏ vô trùng.
- Pha dung dịch pha dung dịch trứng 1/4 (cứ 10 ml lòng đỏ trứng thêm 40 ml nước cất vô trùng), khuấy đều. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4oC.
- Thời gian sử dụng không quá 1 ngày.
* Môi trường Baird Parker hoàn chỉnh
Trước khi sử dụng, mỗi chai chứa 90ml môi trường cơ bản Baird-Parker thêm vào các thành phần phụ như sau:
- 1 ml dung dịch tellurite de potassium 1% - 10 ml dung dịch lòng đỏ trứng 1/4
Sau đó đổ vào hộp lồng và bảo quản nhiệt độ lạnh 4oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Sinh phẩm xác định Coagulase
Staphytect-Plus: sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Huyết tương thỏ.
7. Plate Count Agar (PCA)
Pepton từ casein 5,0 g
Cao nấm men 2,5 g
Glucose (C6H12O6) 1,0 g
Agar-agar 9,0 -18,0 g
Nước 1.000 ml
Hòa tan các thành phần trên trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn, chỉnh pH = 7,0 ± 0,2 ở 25oC. Phân vào chai 100ml môi trường. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 ± 1oC/15 phút.
* Nếu là môi trường bột khan pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 8. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)
Nồng độ đơn Nồng độ kép
Dịch thủy phân casein 10,0 g 20,0 g
Lactose 10,0 g 20,0 g
Mật bò khô 20,0 g 40,0 g
Brilliant Green 0,0133 g 0,0266 g
Nước 1.000 ml 1.000 ml
Hòa tan các thành phần trong lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH 7,2 ± 0,2. Phân vào các ống nghiệm 16 mm x160 mm mỗi ống nghiệm 10ml môi trường. Mỗi ống nghiệm có chuông Durham. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC/15 phút. (Chú ý: những chuông Durham không được có bọt khí sau tiệt trùng).
9. Môi trường Kligler–Hajna (KIA)
Extrait de viande 3,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Digestat enzymatique de caseine 20,0 g
NaCl 5,0 g
Lactose 10,0 g
Ferrous Ammonium Sulfate 0,5 g Thiosulfate de sodium (Na2S2O3) 0,5 g
Rouge de phenol 0,025 g
Agar-agar 12g - 18 g
Nước cất 1.000 ml
Hòa tan các thành phần trên vào trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn, chỉnh pH: 7,4 ± 0,2 ở 25oC. Phân 10ml mỗi ống nghiệm 16mm x 160mm. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC±1oC/10 phút. Sau khi tiệt trùng để nghiêng sao cho phần đứng khoảng 2,5 cm (đặt ống nghiệm góc 20 độ).
* Nếu là môi trường bột khan pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 10. Sulfur Indol Mobility (SIM)
Pancreatic Digest of Casein 20,0 g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Peptic Digest of Animal Tissue 6,1 g
Ferrous Ammonium Sulfate 0,2 g
Sodium Thiosulfate 0,2 g
Agar-agar 3,5 g
Nước cất 1.000 ml
Hòa tan 30 g thành phần trong lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH 7,3 ± 0,2. Phân vào các ống nghiệm 16 mm x100 mm mỗi ống nghiệm 8ml môi trường. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC/15 phút.
11. Simmons Citrate Agar
Ammonium Dihydrogen Phosphate 1,0 g
Dipotassium Phosphate 1,0 g Sodium Chloride 5,0 g Sodium Citrate 2,0 g Magnesium Sulfate 0,2 g Bromthymol Blue 0,08 g Agar-agar 15,0 g Nước 1000 ml
Hòa tan 4,2 g thành phần trên trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH 6,9 ± 0,2. Phân vào các ống nghiệm 12 mm x100 mm mỗi ống nghiệm 4 ml môi trường. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC/15 phút. Sau khi tiệt trùng xong để nguội 47oC để ống nghiệm nghiêng. Chờ thạch đông lại. Bảo quản tủ lạnh 4oC.
12. Eosin Methyl ene Blue (EMB)
Hòa tan 4,2 g thành phần trên trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH 6,9 ± 0,2. Phân vào các ống nghiệm 14 mm x100 mm mỗi ống nghiệm 4ml môi trường. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 1210C/15 phút.
13. Môi trường Voges-Proskauer (VP)
Peptone 7,0 g
Glucose 5,0 g
NaCl 5,0 g
K2HPO4 5,0 g
Nước cất 1.000 ml
Hòa tan các thành phần trên trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn, chỉnh pH = 7,0 ± 0,2. Phân chia vào ống nghiệm (12mm x 120 mm) 5ml môi trường. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 ± 10C/15 phút..
14. Thuốc thử KOVAC’S
ρ.Dimethylamino benzaldehyde 5,0 g
Isoamyl Alcool 75,0 ml
Axite Chlorhydrique 25,0 ml
Hòa tan 5 g ρ.Dimethylamino benzaldehyde vào trong 75 ml Isoamyl Alcool (nếu không tan đun cách thủy nhẹ khoảng 45-500C). Sau khi tan hoàn toàn đổ từ từ 25ml HCL vào (trong điều kiện lạnh). Sản phẩm cuối cùng có màu vàng nhạt trong suốt như dầu oliu.
15. Thuốc thử cho VP
* Dung dịch α-Naphtol
α-Naphtol (C10H8O) 6,0 g
Alcool ethylique 100 g
* Dung dịch Kali hydroxit
KOH 40 g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nước cất 100 ml
16. Thuốc thử Methyl red
Đỏ Methyl 0,1 g
Alcohol 95% 300 ml
Nước cất 500 ml
17. Canh thang thioglycolate