Phổ tương quan huỳnh quang – FCS (Fluorescence correlation spectroscopy) dựa trên phân tích thống kê sự thăng giáng của cường độ huỳnh quang theo thời gian [80-83]. FCS được tiến hành với các phần tử phát huỳnh quang khuếch tán tự do. Đây
là phương pháp dựa trên tín hiệu của từng phân tử hoặc một số ít các phân tử. Thăng giáng tín hiệu huỳnh quang tối ưu khi chỉ có một vài phân tử trong thể tích đo.
Khi một phần tử phát quang khuếch tán vào trong một chùm ánh sáng hội tụ, sẽ có một đám (burst) các photon phát xạ do có nhiều vòng lặp kích thích – phát xạ từ cùng một phần tử phát quang (hình 1.9). Phần tử phát quang kích thước nhỏ khuếch tán nhanh ra khỏi thể tích, do đó, đám photon sẽ ngắn. Nếu phần tử phát quang khuếch tán chậm hơn (kích thước lớn, hoặc độ nhớt cao), đám photon sẽ kéo dài.
Tốc độ khuếch tán tại một nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào kích thước của phần tử phát quang và độ nhớt của môi trường. Hệ số khuếch tán DT và bán kính động lực học của hạt Rh có mối liên hệ theo phương trình Stokes-Einstein:
�T
�� =
6��� h (1.11)
Quá trình khuếch tán của phần tử phát quang gây ra sự thăng giáng của cường độ huỳnh quang F(t) trong một thể tích rất nhỏ. Sự thăng giáng của tín hiệu huỳnh quang F(t) được định nghĩa là sự sai lệch khỏi giá trị trung bình theo thời gian của
cường độ tín hiệu 〈�(�)〉[80, 83-85]:
�� (�) = �(�) −
〈�(�)〉
với 〈�(�)〉= 1 ∫T �(�)�� (1.12)
T 0
Hình 1.9. Tính toán đường tương quan huỳnh quang từ cường độ huỳnh quang phụ thuộc thời gian [80].
Hàm tương quan thực nghiệm G() chuẩn hóa được định nghĩa như sau [80, 83-86]:
�(�) =〈�� (�) ∙〈�(�) 2 ��〉( +� �)〉= 〈�(�) ∙ �(�+ ) 〉− 1 (1.13)
〈�(�)
〉
Đối với một loại hạt khuếch tán tự do theo ba chiều không gian, với tính chất huỳnh quang không thay đổi theo thời gian quan sát, hàm tương quan G() được biểu diễn theo phương trình lý thuyết sau [80, 83, 86-88]:
�(�) =� 1〈�〉∙ 1 c∙ 1 2 = �1 ∙ 1 c ∙ 1 c (1.14) eff (1 + ) cD 1 + ( ) ∙ r c z0 cD (1 + ) cD J1 + 2 ∙ cD là thời gian trễ,
D được gọi là thời gian khuếch tán của phân tử/hạt, là thời gian suy giảm
đặc trưng của hàm tương quan G(). Tại giá trị = D, G ½ G(0). N là số hạt trung bình trong thể tích đo,
= r0 /z0 với r0 và z0 là các thông số của thể tích đo. Ánh sáng kích thích trong thể tích đo có phân bố không gian ba chiều dạng hàm Gauss. Tại vị trí r = r0 theo phương bán kính và tại z = z0 theo phương trục, cường độ kích thích suy giảm còn 1/e.
C là nồng độ trung bình của phần tử phát quang,
Veff là thể tích đo hiệu dụng, 3
2 0
D, N và tìm được bằng cách so sánh bình phương tối thiểu phi tuyến các hàm tương quan G() thực nghiệm và lý thuyết. Kích thước r0 và z0 thường được xác định từ đo đạc FCS với phân tử phát quang đã biết hệ số khuếch tán.
Giữa D và hệ số khuếch tán DT (giá trị của DT phụ thuộc nhiệt độ T, không phụ thuộc vào cấu hình của hệ đo) có mối liên hệ:
�D = �2 4 ∙ �T
(1.17)
trong đó T là nhiệt độ Kelvin, k là hằng số Boltzmann, là độ nhớt của môi trường. Như vậy, từ giá trị của D trong hàm tương quan G() có thể tìm được hệ số khuếch tán DT và từ đó tính được bán kính thủy động lực học Rh của hạt.
0
�eff = �2 ∙ � ∙ �
0