CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.10.CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN
1.10.1. Thu hồi protein
Sự thu hồi và tinh sạch các protein và enzyme cũng quan trọng như các giai đoạn lên men xét theo góc độ kinh tế của quá trình sản xuất. Thách thức chính trong các bước thu hồi là giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein. Trong phần này sẽ trình bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein.
1.10.2. Tinh sạch sơ bộ
Tinh sạch protein là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối với những protein có giá trị ứng dụng cao. Quy mô của quá trình tinh sạch sẽ quyết định sự chọn lựa kỹ thuật phân tách, vì một số kỹ thuật gặp nhiều khó khăn khi tiến hành trên quy mô lớn.
1.10.3. Hệ phân tách hai pha nước
Một phương pháp khác với ly tâm và lọc là phương pháp phân tách hai pha nước (aqueous two-phase separation), hay chất lỏng-chất lỏng. Các hệ hai pha nước đặc trưng được tạo ra bằng cách trộn các dung dịch polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại muối như potassium phosphate hoặc ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì thế kỹ thuật này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia (partitioning) protein trong suốt quá trình tinh sạch.
1.10.4. Các phương pháp kết tủa
Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa mẻ đầu tiên để làm giảm thể tích tổng số của dung dịch enzyme.
Các enzyme có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc phối hợp với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleneimine và polyallylamine,
hoặc với các dung môi hữu cơ như là isopropanol, ethanol và acetone.
a. Các phương pháp sắc ký
Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tách sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.
b. Siêu lọc
Siêu lọc đã trở thành một kỹ thuật tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm để cô đặc các dung dịch protein dưới các điều kiện rất ôn hòa. Phương pháp này được sử dụng trong trường hợp thẩm tách hoặc lọc gel để khử muối hoặc trao đổi đệm. Bằng cách dùng các chất kết tủa ái lực để tăng khối lượng phân tử của protein mong muốn, phương pháp này cũng có thể được dùng như một kỹ thuật tinh sạch.
c. Thiết kế các protein để tinh sạch
Các nhân tố ở quá trình chuẩn bị cơ chất và nguyên liệu sản xuất (upstream processing) có thể ảnh hưởng đến sự phát triển phương thức tinh sạch protein sau này, công nghệ DNA tái tổ hợp cũng có một ảnh hưởng quan trọng lên sự tinh sạch protein. Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một trình tự promoter hiệu quả, thì một protein ngoại lai có thể được biểu hiện trong cơ thể vật chủ từ 10 tới 40% protein tổng số hòa tan của tế bào. Điều này có thể so sánh với sự biểu hiện của nhiều protein nguyên thể (chỉ chiếm khoảng 0,01 tới 4% protein tổng số hòa tan của tế bào). Vì vậy, quá trình tinh sạch tiếp theo của protein được đơn giản hóa. Đối với các protein được biểu
hiện trong một dạng hòa tan, các kỹ thuật di truyền có thể được dùng để hướng tới việc protein được tổng hợp mới trong gian bào, hoặc thậm chí trong môi trường nuôi cấy. Điều này có thể làm tăng sự ổn định của protein được biểu hiện (vì chỉ hai trong số tám protease được biết của E. coli là hoàn toàn ở trong gian bào) và đơn giản hóa sự tinh sạch (vì chỉ khoảng 8% của tất cả protein của E. coli là ở khoang gian bào).