7. Bốc ục luận văn
1.10.CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN
1.10.1. Thu hồi protein
Sự thu hồi và tinh sạch các protein và enzyme cũng quan trọng như các giai đoạn lên men xét theo góc độ kinh tế của quá trình sản xuất. Thách thức chính trong các bước thu hồi là giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein. Trong phần này sẽ trình bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein.
1.10.2. Tinh sạch sơ bộ
Tinh sạch protein là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối với những protein có giá trị ứng dụng cao. Quy mô của quá trình tinh sạch sẽ quyết định sự chọn lựa kỹ thuật phân tách, vì một số kỹ thuật gặp nhiều khó khăn khi tiến hành trên quy mô lớn.
1.10.3. Hệ phân tách hai pha nước
Một phương pháp khác với ly tâm và lọc là phương pháp phân tách hai pha nước (aqueous two-phase separation), hay chất lỏng-chất lỏng. Các hệ hai pha nước đặc trưng được tạo ra bằng cách trộn các dung dịch polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại muối như potassium phosphate hoặc ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì thế kỹ thuật này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia (partitioning) protein trong suốt quá trình tinh sạch.
1.10.4. Các phương pháp kết tủa
Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa mẻ đầu tiên để làm giảm thể tích tổng số của dung dịch enzyme.
Các enzyme có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc phối hợp với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleneimine và polyallylamine,
hoặc với các dung môi hữu cơ như là isopropanol, ethanol và acetone.
a. Các phương pháp sắc ký
Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tách sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.
b. Siêu lọc
Siêu lọc đã trở thành một kỹ thuật tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm để cô đặc các dung dịch protein dưới các điều kiện rất ôn hòa. Phương pháp này được sử dụng trong trường hợp thẩm tách hoặc lọc gel để khử muối hoặc trao đổi đệm. Bằng cách dùng các chất kết tủa ái lực để tăng khối lượng phân tử của protein mong muốn, phương pháp này cũng có thể được dùng như một kỹ thuật tinh sạch.
c. Thiết kế các protein để tinh sạch
Các nhân tố ở quá trình chuẩn bị cơ chất và nguyên liệu sản xuất (upstream processing) có thể ảnh hưởng đến sự phát triển phương thức tinh sạch protein sau này, công nghệ DNA tái tổ hợp cũng có một ảnh hưởng quan trọng lên sự tinh sạch protein. Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một trình tự promoter hiệu quả, thì một protein ngoại lai có thể được biểu hiện trong cơ thể vật chủ từ 10 tới 40% protein tổng số hòa tan của tế bào. Điều này có thể so sánh với sự biểu hiện của nhiều protein nguyên thể (chỉ chiếm khoảng 0,01 tới 4% protein tổng số hòa tan của tế bào). Vì vậy, quá trình tinh sạch tiếp theo của protein được đơn giản hóa. Đối với các protein được biểu
hiện trong một dạng hòa tan, các kỹ thuật di truyền có thể được dùng để hướng tới việc protein được tổng hợp mới trong gian bào, hoặc thậm chí trong môi trường nuôi cấy. Điều này có thể làm tăng sự ổn định của protein được biểu hiện (vì chỉ hai trong số tám protease được biết của E. coli là hoàn toàn ở trong gian bào) và đơn giản hóa sự tinh sạch (vì chỉ khoảng 8% của tất cả protein của E. coli là ở khoang gian bào).
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 2.4.1. Thu gom và xử lí nguyên liệu 2.4.1. Thu gom và xử lí nguyên liệu
Hạt chùm ngây dùng làm nguyên liệu được lấy từĐăk Lăk, Việt Nam. Hạt Chùm ngây sau khi thu mua loại bỏ vỏ và các hạt hư hỏng không đạt chất lượng, sấy nhẹ ở 40oC, sau đó nghiền nhỏ và bảo quản trong hộp kín.
Hình 2.1. Chùm ngây
2.4.2. Dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh
- Máy đo pH, cân phân tích - Máy khuấy từ
- Bình hút ẩm, chén sứ - Bộ chiết soxhlet
- Bếp cách thủy (Trung Quốc) - Máy li tâm, máy đo độđục - Rây đường kính 0,5mm
Hình ảnh một số thiết bị:
Hình 2.2. Lò nung Hình 2.3. Tủ sấy
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.4. Máy đo độđục 2100 AN IS, 230Vas Hình 2.5. Máy đo pH
2.4.3. Hóa chất
- Dung dịch n - hexan - Dung dịch HCl, NaOH - NaCl
SƠĐỒ CHIẾT TÁCH PROTEIN TỪ HẠT CHÙM NGÂY VÀ XỬ LÝ NƯỚC ĐỤC Bóc bỏ hạt Hạt chùm ngây Nhân Sàng, lọc qua rây Bột mịn
yếu tố tối ưu Sấy nhẹ 40oC Nghiền Chiết tách Soxhlet bằng dung môi Tỉ lệ rắn - lỏng Thời gian Nhiệt độ Nồng độ NaCl Xác định Bã Dầu Dịch chiết Protein Mẫu nước đục tự nhiên Hàm lượng tro Độ ẩm Xác định
Đưa vào trong xử lý nước đục Độ đục (NTU) Độ pH Xác định Xác định thông số, kết quả và kết luận. các thông số Protein dạng bột Li tâm
2.2. XÁC ĐỊNH ĐỘẨM
- Mục tiêu
Dược liệu thường được qui định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độẩm đó thì nguyên liệu dễ bị mốc, hư hỏng.[9]
Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho nguyên liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản. Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn. Ðể bảo quản tốt, dược liệu cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độẩm an toàn
- Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
- Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 chén sứ có kí hiệu sẵn, rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến nhiệt độ >1000C. Sau khi sấy xong, lấy chén ra, bỏ vào bình hút ẩm, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân khối lượng các chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi ta được khối lượng m0 (gam).
Cân m1 (gam) khối lượng bột chùm ngây. Cho vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 1050C trong thời gian 5h. Sấy xong lấy mẫu ra khỏi tủ, đậy nắp chén, làm nguội trong bình hút ẩm sau đó đem cân, cứ như vậy đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi (tức khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0.005 gam) ta được khối lượng m2 (gam).
Độẩm của mỗi mẫu được xác định theo công thức: (%) = (m + mm )− m × 100% Độẩm trung bình của nguyên liệu
(%) =∑ (%) 3
Trong đó: m0 : khối lượng của chén sứ (g). m1 : khối lượng của mẫu (g).
m2 : khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g). W(%) : Độẩm của mỗi mẫu.
WTB(%) : Độẩm trung bình.
2.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRO
- Mục tiêu
Xác định hàm lượng tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong dược liệu. Đây là thành phần các chất vô cơ của dược liệu, nhưng cũng có thêm những tạp chất vô cơ (như đất, cát) lẫn vào dược liệu. Các loại cây khác nhau, sinh trưởng ở những vùng khác nhau sẽ có thành phần các chất vô cơ khác nhau.
- Nguyên tắc
Phá hủy hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ 5250C± 250C đến khối lượng không đổi.
- Cách tiến hành
Từ 3 mẫu đã được xác định độ ẩm ở thí nghiệm ở trên, tiếp tục đem đi than hóa trên bếp điện đến khi cháy thành than thì ngừng, tiếp theo cho mẫu vào lò nung và tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 5000C trong thời gian 6h - 10h cho đến khi thu được tro màu xám trắng.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiêt độ phòng trong bình hút ẩm, sau đó đem cân, cứ như vậy đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi (tức khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0.001 gam) ta được khối lượng m3 (gam).
Hàm lượng tro của mỗi mẫu được tính theo công thức M=100 -
Hàm lượng trung bình của 5 mẫu Mtb= ∑ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: m0 : khối lượng của chén sứ (g). m1 : khối lượng của mẫu (g).
m3 : khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa mẫu (g).
M(%) : Hàm lượng tro của mỗi mẫu. MTB(%) : Hàm lượng tro trung bình.
2.4. QUÁ TRÌNH CHIẾT SOXHLET HẠT CHÙM NGÂY[19], [20], [22] 2.4.1. Tách dầu từ hạt chùm ngây 2.4.1. Tách dầu từ hạt chùm ngây
Cân khoảng 10g hạt chùm ngây xay thành bột đã được xử lý cho vào túi vải (lưu ý túi vải màu trắng có độ co dãn, không làm thất thoát mẫu, phải được giặt sạch và nấu trong nước cất khoảng 1h-2h), sau đó cho vào bộ chiết soxhlet 250ml. Cho vào bộ chiết soxhlet 100ml thể tích dung môi n-hexan. Sau khi chiết trong 8h lấy bã ra và để khô trong 24 giờ và chuẩn bị cho tách lấy protein.
2.4.2. Tách protein từ bã đã tách dầu
Tiến hành lần lượt các nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách như sau
a. Ảnh hưởng của tỉ lệ bã trên thể tích nước
Điều kiện tiến hành: thể tích nước = 100 ml, thời gian tách: 60 phút, khuấy mạnh ở nhiệt độ phòng, khối lượng bã thay đổi: 1g; 2g; 3g; 4g; 5g. Lọc để tách chất rắn. Sau khi tách thì cô cạn để tính lượng rắn thu được.
Chọn điều kiện tỷ lệ khối lượng bã/100 ml H2O tốt nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết tách
mạnh ở nhiệt độ phòng.
Thay đổi thời gian chiết tách: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút.
Sau khi tách thì cô cạn, cân khối lượng rắn trên cân phân tích từ đó tìm ra nhiệt độ tối ưu.
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng chiết tách protein từ bã chùm ngây
Điều kiện tiến hành: Sau khi khảo sát tỉ lệ bã trên thể tích NaCl và thời gian chiết tách ta tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ của NaCl đến khả năng chiết tách. Thể tích NaCl = 100 ml, khối lượng: tối ưu, khuấy mạnh, thời gian chiết tách: tối ưu, nồng độ NaCl thay đổi: 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mol/L. Sau khi khuấy xong ta tách và cô cạn, cân khối lượng rắn trên cân phân tích sau đó tìm ra nồng độ tối ưu.
d. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết tách protein từ bã chùm ngây
Điều kiện tiến hành: thể tích NaCl = 100 ml, khối lượng: tối ưu, thời gian chiết tách: tối ưu, nồng độ NaCl: tối ưu, nhiệt độ thay đổi: 40, 50, 60, 70, 80 (oC). Tiến hành khuấy trong các điều kiện chiết tách tối ưu đã khảo sát ở trên. Sau khi lọc thu được lượng rắn, cô cạn và cân khối lượng rắn từ đó tìm ra nhiệt độ tối ưu.
Sau khi có các điều kiện tối ưu ta tiến hành khuấy bã chùm ngây đã qua chiết soxhlet trong điều kiện đó. Tiếp theo tiến hành lọc huyền phù sau khi khuấy trộn qua giấy lọc, dịch lọc được đựng trong các bình tam giác có kí hiệu sẵn.
2.5. QUI TRÌNH ĐIỀU CHẾ PROTEIN DẠNG BỘT 2.5.1. Kết tủa protein
tinh protein có thể tiến hành cho dịch chiết vào trong môi trường có nhiệt độ hạ thấp. Để quá trình kết tinh dễ dàng thì người ta hạ nhiệt độ khoảng 0 - 5oC đồng thời cho thêm 5ml axeton vào tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh.
2.5.2. Tách kết tủa protein khỏi dung dịch
Một trong những kỹ thuật không thể thiếu được trong việc tách chiết và tinh chế protein là ly tâm.
Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dung dịch. Người ta gọi pha lỏng là chất lỏng bên trên kết tủa, pha rắn mà thường lắng kết xuống đáy ống ly tâm được gọi là kết tủa. Thực chất, sự ly tâm tăng tốc độ kết tủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm. Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các protein, khi tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh. Trong trường hợp điều kiện thí nghiệm có hạn chế, có thể sử dụng một số phương cách nhằm đảm bảo duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp. Cần làm lạnh tốt mẫu và ống ly tâm trước khi ly tâm. Cần phải tiến hành ly tâm với thời gian tối thiểu để tránh nóng máy.
Lấy dịch chiết kết tủa ở nhiệt độ thấp cho vào các ống nghiệm đã được làm lạnh trước đó. Tiến hành ly tâm trong vòng 15 phút với tốc độ trung bình… ta thu được kết tủa bám chặt dưới đáy ống nghiệm và phần dung dịch nằm ở trên. Đổ phần dung dịch đi ta được protein ở dạng kết tủa.
2.5.3. Tạo protein dạng bột
Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng. Nếu dung dịch protein bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein bị biến tính. Protein chỉ có thể được giữ ở dạng khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp. Kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng acetone và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính. Ở dạng khô, bột protein có thể giữ
một thời gian lâu, khi hòa tan nó trong nước nó thể hiện những tính chất ban đầu của mình.
Sau khi li tâm kết tủa thu được cho vào một ít axeton và sấy thật nhanh ta sẽ thu được protein dạng bột không bị biến tính.
2.6. XỬ LÝ NƯỚC NGHIÊN CỨU 2.6.1. Mẫu nước nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thông số mẫu nước đục ban đầu được lấy từ kênh gần trường Đại học sư phạm, quận Liên Chiểu, Đà Nẵng (gần với nhà máy sản xuất nước giải khát Cocacola).
Một vài thông tin cơ bản về mẫu nước này
Độđục (NTU) Độ pH Màu sắc
16 9,0 Vàng nâu
2.6.2. Dịch chiết protein từ hạt chùm ngây trong NaCl [23], [24]
a. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết với nước đục với khả năng lọc nước
Thí nghiệm này được sử dụng đểđánh giá hiệu quả của quá trình keo tụ và tạo bông ứng với các nồng độ khác nhau của chất keo tụ lên từng mẫu nước. Ta tiến hành thử nghiệm trên 5 cốc thủy tinh 250ml. Cho khoảng 200ml mẫu nước đục và cốc, sau đó bổ sung dịch chiết hạt chùm ngây theo nồng độ đã định trước sau cho tỉ lệ dịch chiết so với mẫu nước lần lượt là 1:60, 1:80, 1:100, 1:120, 1:140. Tiếp theo mẫu nước đục được để lắng trong vòng 24h trước khi đem phân tích chất lượng nước đã lắng. Thí nghiệm được tiến hành song song với một mẫu nước đối chứng là mẫu không bổ sung chất keo tụ. Tất cả thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phòng.
b. Ảnh hưởng của pH lên quá trình xử lí nước đục
cốc, dùng máy đo pH để điều chỉnh pH của mỗi cốc từ mẫu nước ban đầu có pH = 9 thành các mẫu nước có pH lầm lượt là: 6, 7, 8, 9, 10. Lấy tỉ lệ dịch chiết so với mẫu nước tối ưu cho vào từng cốc. Tiếp theo mẫu nước đục được