PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Bố trí thí nghiệm và đánh giá cảm quan đống ủ

Thí nghiệm được bố trí theo 3 công thức tương ứng với các tỷ lệ EM khác nhau và được lặp lại 3 lần, mỗi lần được thực hiện trên 25 bịch. Các công thức thí nghiệm và ký hiệu cụ thể như sau:

Bảng 2.1. Ký hiệu các công thức thí nghiệm

TT Ký hiệu Công thức thí nghiệm

1 CT1 (Đ/C) 35kg mùn cưa + 1% vôi

2 CT2 (EM1) 35kg mùn cưa gỗ keo + 0,5% vôi + 1 lít EM 3 CT3 (EM2) 35kg mùn cưa gỗ keo + 2 lít EM Cách thực hiện:

Xử lý nguyên liệu: Tùy vào công thức trên mà ta xử lý nguyên liệu bằng vôi hoặc bằng chế phẩm với độ ẩm đạt từ 65-70%. Đống ủ được che chắn bằng bạt nhựa hoặc nilon để tránh tác động từ bên ngoài ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu, sau 3 ngày ta tiến hành đảo trộn đống ủ. Tiếp tục ủ trong vòng 7-10 ngày để cho các vi sinh vật trong chế phẩm EM phân giải các chất dinh dưỡng trong cơ chất (3 ngày đảo trộn 1 lần). Sau 10 ngày ủ ta tiến hành đánh giá cảm quan đống ủ: nắm một nắm mùn cưa chặt trong lòng bàn tay và thả ra hơi vỡ rời, nguyên liệu đã được chuyển thành màu nâu, nhiệt độ đống ủ từ 70-750C là đạt yêu cầu.

Sau khi ủ xong thì tiến hành tơi, đảo trộn đều đống ủ và phối trộn mùn cưa với các nguyên liệu khác như: cám bắp, cám gạo, bột nhẹ. Tỷ lệ bột nhẹ giảm dần theo các công thức với tỷ lệ (1:0;5:0) và được đóng trong túi nilon chịu nhiệt, mỗi bịch nặng khoảng 1,2-1,4kg. Sau đó đưa vào nồi hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1atm trong 24 giờ (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2010).

Cấy giống: Sau khi hấp xong các bịch phôi được chuyển vào phòng cấy để nguội, rồi tiến hành cấy giống. Bịch sau khi cấy giống được chuyển nhẹ nhàng để đặt trên các giàn, miệng túi quay nằm ngang. Khoảng cách giữa các túi cấy từ 2-3cm, giữa các giàn luống có lối đi để kiểm tra nấm. Trong thời gian ra sợi không tưới, không di chuyển bịch. Trong quá trình sợi nấm phát triển thường xuyên theo dõi và kiểm tra để loại bỏ các túi bị nhiễm mốc xanh, mốc đỏ. Trong quá trình theo dõi khi thấy hệ sợi bắt đầu bện kết, quả thể xuất hiện thì tháo nút bông ở cổ bịch ra. Tiến hành tưới phun sương để duy trì độ ẩm 80– 95%, nhiệt độ từ 22-280C, độ thông khí cao, không nên quá ẩm vì dễ phát sinh ẩm mốc. Khi quả thể trưởng thành tiến hành thu quả thể: dùng dao nhọn cắt sát cuống quả thể sao cho không phạm đến phần cơ chất trồng nấm, sau đó dùng cồn thoa lên vết cắt. Tiếp tục duy trì độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng thích hợp để đón quả thể nấm đợt hai.

2.2.2. Phương pháp đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của nấm Linh chi

- Thời gian tơ nấm phủ kín bịch của các nghiệm thức (ngày): tính số ngày từ khi cấy giống đến lúc lan tơ đầy kín tất cả các bịch phôi của các thí nghiệm.

-Thời gian hình thành quả thể (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy tơ nấm vào bịch phôi đến khi quả thể đầu tiên nhú ra khỏi bịch phôi.

2.2.3. Phương pháp đánh tỷ lệ nhiễm trong quá trình nuôi trồng

Tỷ lệ nhiễm được xác định qua công thức:

Tổng số bịch phôi bị nhiễm

Tổng số bịch phôi nuôi cấy được X 100

2.2.4. Phương pháp đánh giá hình thái nấm Linh chi

Kích thước của quả thể nấm Linh chi được đánh giá bởi các chỉ tiêu như: đường kính tán (cm), độ dài tán (cm), chiều cao cuống (cm), đường kính cuống (cm).

2.2.5. Phương pháp đánh giá năng suất khô của nấm Linh chi

Quả thể nấm Linh chi sau khi thu hoạch được sấy ở nhiệt độ 550C cho đến khi khối lượng không đổi. Sau đó tiến hành đem cân tổng khối lượng khô ở mỗi CT khác nhau để so sánh năng suất khô của nấm Linh chi.

2.2.6. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Atomic Absorbtion Spectrometric (AAS)

Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử có nhiều ưu việt như: độ nhạy, độ chính xác cao; lượng mẫu tiêu thụ ít; tốc độ phân tích nhanh. Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu phân tích trong cuvet graphit nhờ năng lượng nhiệt của dòng điện có công suất lớn, ta có phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF –ASS) có độ nhạy cao hơn kỹ thuật ngọn lửa 50-1000 lần; cỡ 0,1 – 1ppb và sai số không vượt quá 15%.

Phương pháp xử lý mẫu: để xác định hàm lượng Cd và Pb trong nấm trước hết phải tiến hành xử lý mẫu nhằm chuyển các nguyên tố cần xác định có trong mẫu từ trạng thái ban đầu (dạng rắn) về dạng dung dịch. Đây là công việc rất quan trọng vì nó có thể dẫn đến những sai lệch trong kết quả phân tích.

Nguyên tắc: dùng axit có đặc tính oxy hóa mạnh (HNO3, HClO4…), hay hỗn hợp các axit đặc có tính oxy hóa mạnh (HNO3 + HClO4) hoặc hỗn hợp một axit mạnh và một chất oxy hóa mạnh (HNO3 + H2O2),… để phân hủy hết chất hữu cơ và chuyển các kim loại ở dạng hữu cơ về dạng các ion trong dung dịch muối vô cơ. Việc phân hủy có thể thực hiện trong hệ đóng kín (áp suất cao), hay trong hệ mở (áp suất thường). Lượng axit thường phải dùng gấp từ 10-15 lần lượng mẫu, tùy thuộc mỗi loại mẫu và cấu trúc vật lý, hóa học của nó. Thời gian phân hủy mẫu trong các hệ mở, bình Kendan, ống nghiệm, cốc…thường từ vài giờ đến hàng chục giờ, cũng tùy loại mẫu và bản chất các chất, còn nếu dùng lò vi sóng hệ kín thì chỉ cần vài chục phút. Khi phân hủy xong phải đuổi hết axit dư trước khi định mức và tiến hành đo phổ.

2.2.7. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch trên đĩa thạch

Cao chiết ethanol từ nấm Linh chi được pha trong dung dịch DMSO 10% vô trùng thành các nồng độ khác nhau. Kháng sinh đối chứng là tetracyclin với nồng độ 10 mg/ml pha trong nước cất vô trùng. Chứng âm là DMSO 10% vô trùng.

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của cao chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch của Hadacek và cs (2000). Do đó, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo đường kính vòng ức chế vi sinh vật (DK) theo công thức:

DK (mm) = D – d

Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính giếng thạch.

Kháng sinh ở trong giếng thạch sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch (Ngô Xuân Mạnh và cs, 2015; Hadacek và cs, 2000)

Cách tiến hành:

Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nấm thực hiện theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch bằng cách đục giếng thạch. Cấy trang dịch nuôi cấy Escherichia coli lên đĩa môi trường thạch LB. Sau đó, mỗi đĩa peptri đục 3 giếng thạch gồm:

- 1 giếng chứa 0,1 ml cao chiết từ nấm Linh chi (pha trong DMSO 10%) - 1 giếng chứng âm chứa 0,1 ml DMSO 10% vô trùng

- 1 giếng chứa chứng dương chưa 0,1 ml kháng sinh tetracyclin

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả các số liệu được biểu thị bằng giá trị số trung bình và độ lệch chuẩn (Mean±SD). Xử lý thống kê dựa vào phân tích ANOVA. Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% bằng phần mềm SPSS 16.0.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN SỢI NẤM LINH CHI TRIỂN SỢI NẤM LINH CHI

Thời gian sinh trưởng của hệ sợi nấm rất quan trọng, có tính chất quyết định đến sự sinh trưởng, phát triển của quả thể và năng suất của nấm Linh chi.

Giống cấp 2 được cấy vào bịch theo từng CT khác nhau. Mỗi CT được đóng 25 bịch, mỗi bịch nặng 1,4kg. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Tiến hành quan sát thời gian tơ lan kín bịch, xuất hiện quả thể và quả thể trưởng thành. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua Bảng 3.1:

Bảng 3.1. Sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm ở các nghiệm thức

Công thức Hệ sợi phủ kín bịch (ngày)

Xuất hiện quả thể (ngày) Quả thể trưởng thành (ngày) CT1 45,3 ± 2.51a 30 ± 2a 76,6 ± 0,54a CT2 39,67 ± 2.08b 27,3 ± 0.57b 76,2 ± 0,46a CT3 36,33 ± 1.52c 24,67 ± 0.57c 68,2 ±0,41b

(Chú thích: Số liệu trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ số khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%)

Hình 3.1. Hệ sợi nấm phủ kính bịch trong 37 ngày trên ba CT: A: CT1; B: CT2; C: CT3

Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.1 cho thấy thời gian từ khi cấy giống đến khi hệ sợi nấm phủ kín bịch ở mỗi công thức là khác nhau dao động từ 36 – 45 ngày. Thời gian phủ kín bịch ở CT2 là 39,67 ngày và CT3 là 36,33 ngày ngắn hơn công thức CT1 45,3 ngày và sự sai khác này có ý nghĩa thống kê.

Thời gian quả thể trưởng thành ở các công thức có sự khác nhau dao động từ 68,2- 76,6 ngày. Thời gian quả thể trưởng thành ở CT3 là 68,2 ngày sớm hơn so với CT1 (76,6 ngày) và CT2 (76,2 ngày).

Thời gian tơ nấm lan kín bịch, xuất hiện quả thể và quả thể trưởng thành phụ thuộc vào các điều kiện như: nhiệt độ, độ ẩm, cơ chất…việc bổ sung chế phẩm EM làm tăng nguồn vi sinh vật hữu hiệu trong cơ chất. Đồng thời vi sinh vật trong EM còn tham gia vào quá trình phân giải các chất hữu cơ cung cấp nhanh nguồn C và N cho nấm làm cho hệ tơ nấm lan nhanh, kín trắng bịch sớm (Lê Thúy Thùy Trâm, 2016).

3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM ĐẾN TỶ LỆ NHIỄM TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI SỢI QUÁ TRÌNH NUÔI SỢI

Trong quá trình khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của nấm thì việc đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tổng sản lượng nấm thu được. Kết quả đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh ở các công thức Công thức Tỷ lệ nhiễm (%) Đối chứng 25,3 EM1 9,3 EM2 0 C B A

Theo kết quả Bảng 3.2, tỷ lệ bịch phôi bị nhiễm ở các nghiệm thức phối trộn EM thấp (0-9,3%), trong khi đó mẫu đối chứng lại có tỷ lệ nhiễm khá cao (25,3%). Theo nghiên cứu của Sopit Vetayasuporn (2004) đã phát hiện có 20% tỷ lệ nhiễm bệnh ở môi trường không kết hợp EM và 0-5% tỷ lệ nhiễm ở môi trường nuôi cấy kết hợp EM.

Từ Bảng 3.1 và Bảng 3.2 cho thấy có mối tương quan giữa sự sinh trưởng, phát triển và tỷ lệ nhiễm ở các bịch phôi. Khi sự sinh trưởng, phát triển mạnh thì tỷ lệ nhiễm bệnh thấp vì khi bổ sung chế phẩm EM các vi sinh vật sẽ tiết ra enzyme phân giải các chất phức tạp như ligin, cellulose, lingnocellulose thành các chất đơn giản, cung cấp dinh dưỡng giúp nấm phát triển nhanh hơn, tốc độ lan tơ kín bịch sớm ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật có hại. Ngoài ra, trong quá trình phân giải cơ chất nhóm vi khuẩn axit lactic có khả năng sản xuất axit lactic trong giai đoạn tăng trưởng của chúng (Higa, 2001). Axit lactic là chất khử trùng mạnh nó có thể giúp ngăn cản và tiêu diệt các vi sinh vật gây hại cản trở sự phát triển của nấm Linh chi nên sẽ giảm tỷ lệ nhiễm so với mẫu đối chứng.

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM ĐẾN HÌNH THÁI NẤM LINH CHI CHI

Kích thước quả thể không chỉ là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá năng suất mà còn ảnh hưởng đến thị hiếu của người tiêu dùng. Chúng chịu tác động của các yếu tố như: giống, điều kiện ngoại cảnh, chế độ chăm sóc và giá thể trồng. Kích thước của quả thể nấm Linh chi được đánh giá bởi các chỉ tiêu như: đường kính tán (cm), độ dài tán (cm), chiều cao cuống (cm) và đường kính cuống (cm).

Bảng 3.3. Hình thái nấm Linh chi ở các công thức thí nghiệm

Công

thức Đường kính tán (cm)

Độ dày tán (cm)

Chiều cao

cuống (cm) Đường kính cuống (cm)

1 (Đ/C) 8,974 ± 0,941a 1,46 ± 0,04a 1,567 ± 0,12a 2,96 ± 0,13a

2 (EM1) 7,33 ± 0,32b 1,17 ± 0,131b 1,3 ± 0,1b 2,76 ± 0,1ab

3 (EM2) 6,81 ± 0,48b 1,08 ± 0,09b 0,82 ± 0,1c 2,52 ± 0,09b

(Chú thích: Số liệu trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ số khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%).

Hình 3.2. Kích thước nấm Linh chi trưởng thành sau 68 ngày của các công thức thí nghiệm

Từ kết quả trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy, kích thước đường kính tán ở các công thức thí nghiệm dao động từ 6,81 – 8,974 cm. Cụ thể: CT1 đạt lớn nhất (8,974cm), tiếp đến là CT2 (7,33cm), cao hơn so với CT3 (6,81cm).

Chiều cao cuống nấm của các CT dao động từ 0,82 -1,567cm. Cao nhất là CT1 (1,567cm) > CT2 (1,3cm) > CT3 (0,82cm). Kết quả này có sự sai khác có ý nghĩa thống kê.

Đường kính cuống giữa các thí nghiệm dao động từ 2,52 – 2,96 cm và có sự khác biệt giữa các công thức thí nghiệm. Đường kính cuống dài nhất ở CT1 (2,96cm), ngắn nhất ở CT3 (2,52cm).

Qua các kết quả có thể thấy rằng, vi sinh vật có trong chế phẩm đã sử dụng một phần dinh dưỡng của nấm trong quá trình phân giải, dẫn đến kích thước nấm nhỏ hơn so với CT1. Nguyên nhân khác có thể do điều kiện nuôi trồng chưa được đảm bảo để nấm phát triển tốt.

3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM ĐẾN NĂNG SUẤT NẤM LINH CHI THU ĐƯỢC Ở CÁC THÍ NGHIỆM THU ĐƯỢC Ở CÁC THÍ NGHIỆM

Đối với nấm Linh chi, năng suất chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của đường kính tán, độ dày tán, chiều cao và đường kính cuống. Qua quá trình nghiên cứu và phân tích, chúng tôi nhận thấy rằng năng suất của nấm ở các công thức khác nhau chủ yếu là do hai yếu tố đường kính tán và độ dày tán quyết định.

Bảng 3.4. Năng suất của nấm Linh chi trên các công thức thí nghiệm.

Công thức

Năng suất tươi (g/bịch)

Năng suất khô (g/bịch) Tổng KL nấm thu được CT1 56,82 ± 0,907a 15,02 ± 0,55a 285,38 CT2 53,37 ± 0,46b 13,45 ± 0,52b 295,9 CT3 47,701 ± 0,74c 12,2 ± 0,87b 305

Theo kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.4 cho thấy năng suất nấm đạt cao nhất trên CT1 56,82 g/bịch. Năng suất nấm ở CT có bổ sung chế phẩm EM thấp hơn đối chứng nhưng vẫn ở mức tương đối cao. Cụ thể: CT2 (53,37g/bịch) > CT3 (47,701g/bịch). Có thể giải thích rằng khi bổ sung chế phẩm EM vào nguyên liệu trồng nấm thì trong quá trình phân giải và quá trình hô hấp các vi sinh vật đã sử dụng một phần dinh dưỡng có trong bịch nguyên liệu nên đã làm giảm tỷ lệ C/N dẫn đến năng suất g/bịch khi bổ sung EM vào thấp hơn đối chứng.

Tuy nhiên năng suất khô thu được trên tổng bịch ở CT3 là cao nhất đến CT2 và CT1 là thấp nhất, với tổng khối lượng nấm thu được lần lượt là 305g; 295,9g; 285,38g.

Từ kết quả thí nghiệm cho thấy khi bổ sung chế phẩm EM vào khâu xử lý nguyên liệu trồng sẽ giúp nấm phát triển nhanh hơn, tỷ lệ nhiễm thấp hơn và cho thu hoạch sớm hơn dẫn đến năng suất trên tổng bịch cao hơn.

3.5. PHÂN TÍCH KIM LOẠI NẶNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ ATOMIC ABSORBTION SPECTROMETRIC (AAS) THỤ NGUYÊN TỬ ATOMIC ABSORBTION SPECTROMETRIC (AAS)

Nấm được xem là sinh vật có khả năng hấp thụ kim loại nặng, vì vậy việc sử dụng nguyên liệu nuôi trồng nấm có nhiễm kim loại nặng là một trong những nguyên nhân làm cho nấm hấp thụ và tích lũy kim loại nặng trong quả thể, dẫn đến một số loại nấm ăn và

Tình hình nghiên cứu trong nước