6. Cấu trúc của luận văn
1.3. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.3.1. Phƣơng pháp phân hủy mẫu phân tích
Để phân tích một chất trong một đối tƣợng nào đó thì đầu tiên ta phải chuyển chất đó vào dung dịch, nhất là trong trƣờng hợp đối tƣợng phân tích là chất rắn. Có 2 nhóm phƣơng pháp chính để chuyển chất rắn vào dung dịch đó là phƣơng pháp „„ƣớt‟‟ và phƣơng pháp „„khô‟‟.
Muốn xác định các nguyên tố vô cơ trong các hợp chất hữu cơ từ cơ thể động thực vật và chuyển các hợp chất hữu cơ vào dung dịch thì trƣớc hết ta phải chuyển các hợp chất hữu cơ đó thành chất vô cơ. Phƣơng pháp này gọi là vô cơ hóa.
a. Vô cơ hóa bằng phương pháp ‘‘khô’’
chén platin hay thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi. Tuy nhiên trong quá trình nung có thể sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi nhƣ halogen, thủy ngân, lƣu huỳnh… Trong một số trƣờng hợp có thể chỉ cần đốt cháy các chất hữu cơ trong bình kín, dƣới áp suất cao hoặc phân hủy bằng cách nung chảy nhƣ đối với chất vô cơ, nhƣng phải thêm chất oxi hóa nhƣ: KNO3, Na2O2, …
b. Vô cơ hóa bằng phương pháp ‘‘ướt’’
Mẫu phân tích đƣợc chuyển thành dung dịch. Có thể phân hủy chất hữu cơ bằng H2SO4 đặc, hỗn hợp H2SO4 và HNO3, HClO4... hoặc thêm H2O2,
KMnO4 để làm tăng nhanh quá trình phân hủy.
c. Vô cơ hóa bằng phương pháp khô ướt kết hợp
Đây là phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm và là sự kết hợp của 2 phƣơng pháp trên.
1.3.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
a. Giới thiệu chung
Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách và tinh chế để tách chất đó ra khỏi môi trƣờng rắn hoặc lỏng khác. Thƣờng ngƣời ta dùng một dung môi thấp và ít tan trong nƣớc (vì các chất hữu cơ cần tinh chế thƣờng ít tan trong nƣớc), chất đó sẽ chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể dùng phễu riêng để tách riêng dung dịch thu đƣợc ra khỏi nƣớc.
Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp.
Ngƣời ta cũng thƣờng chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt gọi là bình chiết soxhlet (Hình 1.8). Dung môi đƣợc đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy
vào bình chứa hỗn hợp cần chiết tách (thƣờng gói bằng giấy lọc), nó sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dƣới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục đƣợc cất lên. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc dung môi và hiệu quả tƣơng đối cao.
b. Kỹ thuật chiết soxhlet
* Dụng cụ
Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận chứa mẫu bột dƣợc liệu, gồm ba ống: Ống D có đƣờng kính lớn, ở giữa để chứa bột dƣợc liệu; ống B có đƣờng kính trung bình để dẫn dung môi từ bình A bay lên đi vào ống D chứa bột dƣợc liệu; ống E có đƣờng kính nhỏ, là ống thông nhau để dẫn dung môi từ D trả lại bình cầu A. Trên cao nhất là ống C ngƣng hơi.
Hình 1.8. Mô hình bộ dụng cụ chiết soxhlet
* Cách tiến hành
Bột dƣợc liệu khô đựng trong một cái túi bằng giấy lọc đƣợc đặt trực tiếp trong ống D. Lƣu ý đặt vài viên bi thủy tinh dƣới đáy ống D để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở nút mài số 2, nhƣ thế dung môi sẽ thấm ƣớt bột
dƣợc liệu rồi mới chảy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E. Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nƣớc chảy hoàn lƣu trong ống ngƣng hơi. Cắm bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi đƣợc đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi theo ống ngƣng hơi để lên cao hơn nữa, tại đây hơi dung môi bị ống ngƣng hơi làm lạnh, ngƣng tụ thành chất lỏng rớt xuống ống D đang chứa bột dƣợc liệu. Dung môi ngấm vào bột dƣợc liệu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lƣợng dung môi rơi vào ống D và đồng thời cũng dâng lên trong ống E. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút vào bình A, lực hút này sẽ rút lƣợng dung môi đang chứa trong ống D.
Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo nhƣ mô tả lúc đầu. Các hợp chất đƣợc rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết.
Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi và thu đƣợc cao chiết.
* Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp chiết soxhlet
- Ưu điểm:
+ Tiết kiệm dung môi, chỉ một lƣợng ít dung môi mà chiết kiệt đƣợc mẫu cây. Không phải tốn công lọc và châm dung môi mới.
+ Không tốn các thao tác và châm dung môi mới nhƣ các kỹ thuật khác. Chỉ cần cắm điện, mở nƣớc hoàn lƣu là thiết bị sẽ thực hiện sự chiết.
+ Chiết kiệt hợp chất trong bột dƣợc liệu vì bột dƣợc liệu luôn đƣợc chiết liên tục bằng dung môi tinh khiết.
- Nhược điểm:
+ Kích thƣớc của thiết bị làm giới hạn lƣợng bột dƣợc liệu cần thiết. + Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột dƣợc liệu đƣợc trữ
lại trong bình cầu, nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế hợp chất nào kém bền nhiệt dễ bị hƣ hại.
+ Do toàn hệ thống của thiết bị đều bằng thủy tinh và gia công thủ công nên giá thành của một thiết bị khá cao. Thiết bị bằng thủy tinh nên dễ vỡ, trong đó các bộ phận của máy, nhất là các nút mài đƣợc gia công thủ công nên chỉ cần làm bể một bộ phận nào đó thì khó tìm đƣợc một bộ phận khác vừa khớp để thay thế. [9]
1.3.3. Phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
a. Giới thiệu phương pháp
Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật phân tích tƣơng đối mới đã và đang phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và kỹ thuật ở cá nƣớc phát triển. Đối tƣợng của phƣơng pháp phân tích theo phổ hấp thụ nguyên tử là lƣợng nhỏ các kim loại và một số á kim trong rất nhiều đối tƣợng mẫu: quặng, đất, nƣớc, khoáng, các mẫu sinh học, y học, các sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, nƣớc uống, phân bón, vật liệu.
Với trang bị và kỹ thuật hiện nay ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hầu hết các kim loại và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppb (nanogram) với sai số không lớn hơn 15%.
b. Nguyên tắc phép đo
Các nguyên tử ở trạng thái bình thƣờng thì chúng không hấp thụ hay bức xạ năng lƣợng nhƣng khi chúng ở trạng thái tự do dƣới dạng những đám hơi nguyên tử thì chúng hấp thụ và bức xạ năng lƣợng. Mỗi nguyên tử chỉ hấp thụ những bức xạ nhất định tƣơng ứng với những bức xạ mà chúng có thể phát ra trong qúa trình phát xạ của chúng. Khi nguyên tử nhận năng lƣợng chúng chuyển lên mức năng lƣợng cao hơn gọi là trạng thái kích thích. Qúa trình đó gọi là quá trình hấp thụ năng lƣợng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ
nguyên tử. Phƣơng pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một số nguyên tố nhƣ thế đƣợc gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử.
c. Qui trình phép đo AAS
Để thực hiện phép đo phổ háp thụ nguyên tử cần thực hiện các quá trình sau đây:
- Quá trình nguyên tử hóa mẫu
Mục đích của quá trình này là tạo ra các đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích với hiệu suất cao và ổn định. Ta có thể nguyên tử hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa và bằng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa. Đây là giai đoạn quan trọng nhất có ảnh hƣởng đến kết quả đo AAS.
Để thu kết quả phân tích chính xác, phải nghiên cứu và chọn đƣợc các điều kiện tối ƣu cho quá trình nguyên tử hóa mẫu sao cho phù hợp với từng nguyên tố phân tích trong mỗi loại mẫu cụ thể, đó là:
+ Thành phần và tốc độ của hỗn hợp khí đốt tạo ra ngọn lửa. + Tốc độ dẫn dung dịch mẫu.
+ Chiều cao của đèn nguyên tử hóa + Bề dày của môi trƣờng hấp thụ.
+ Độ nhớt của dung dịch mẫu. Dung dịch phân tích và dung dịch dùng để lập đƣờng chuẩn phải đƣợc chuẩn bị trong cùng một điều kiện để có cùng thành phần hóa học, vật lý, đặc biệt là thành phần nền của mẫu, đọ axit, loại axit dùng làm môi trƣờng.
- Nguồn phát bức xạ đơn sắc
Muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, cần phải có nguồn phát tia bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần phân tích để chiếu qua đám hơi nguyên tử tự do của mẫu cần phân tích. Nguồn phát tia bức xạ đơn sắc cần thỏa mãn các yêu cầu sau:
nguyên tố phân tích. Chùm tia phát xạ phải có cƣờng độ (I0) ổn định, lặp lại trong nhiều lần đo khác cùng điều kiện và phải điều chỉnh đƣợc để có cƣờng độ cần thiết cho mỗi phép đo.
- Nguồn bức xạ phải tạo ra đƣợc chùm tia bức xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch nhạy của nguyên tố phân tích. Phổ nền của nó phải không đáng kể.
- Nguồn phát tia bức xạ phải tạo ra đƣợc chùm tia sáng có cƣờng độ cao, không bị ảnh hƣởng bởi các giao động của điều kiện làm việc. Ngoài ra không quá đắt và không quá phức tạp khi sử dụng.
- Quá trình ghi đo
Gồm hệ thống phân ly ánh sáng sau khi hấp thụ, detector, bộ khuếch đại và ghi đo.
Nhờ một hệ thống máy quang phổ, ngƣời ta thu, phân ly và chọn vạch hấp thụ một nguyên tố cần nghiên cứu để đo cƣờng độ của nó. Cƣờng độ đó chính là hấp thụ của vạch phổ. Trong một giới hạn nhất định của nồng độ, giá trị cƣờng độ này là phụ thuộc tuyến tính vào nộng độ C của nguyên tố trong mẫu phân tích. Cƣờng độ của các vạch phổ hấp thụ sau khi đƣợc detector thu nhận và khuếch đại sẽ đƣợc sang hệ thống chỉ thị, ở đây nó đƣợc khuếch đại tiếp và đƣợc xử lý để có đƣợc nồng độ thực của vạch phổ hấp thụ. [10]
1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký khí GC-MS
a. Phương pháp sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật vật lý và hóa lý để tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp. Cơ sở của quá trình sắc ký là các quá trình xảy ra trong cột tách khi mẫu đƣợc nạp vào cột sắc ký. Để thực hiện quá trình sắc ký có hai pha:
- Pha tĩnh thƣờng ở dạng rắn hay lỏng, dƣới dạng màng mỏng bám đều trên bề mặt chất mang trơ chứa trong cột sắc ký.
- Pha động : chất phân tích và dung môi thích hợp.
Quá trình sắc ký xảy ra trong cột chính là quá trình tƣơng tác giữa chất phân tích và pha tĩnh nằm trong cột. Quá trình tƣơng tác có thể theo các tính chất hóa lý nhất định, đó là sự hấp phụ, trao đổi, phân bố, rây phân tử.
Tƣơng ứng ta có tên gọi các phƣơng pháp sắc kí: sắc ký hấp phụ dựa vào tính chất hấp phụ chất phân tích lên trên bề mặt pha tĩnh, sắc ký trao đổi dựa vào sự trao đổi ion cùng dấu giữa chất phân tích với pha tĩnh, sắc ký phân bố dựa vào sự phân bố của chất phân tích lên pha tĩnh…
Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký là quá trình sắc ký đƣợc lặp đi, lặp lại nhiều lần, có thể xảy ra trên giấy, trên bản mỏng, trên cột. Do vậy khả năng tách hoàn toàn và phân tích định lƣợng tƣơng đối chính xác.
b. Phương pháp sắc kí khí (GC)
Sắc kí khí là một trong những phƣơng pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định lƣợng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ.
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải đƣợc hóa hơi để đƣa vào cột sắc kí, thƣờng hóa hơi dƣới 250o
C.
Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc nhồi vào cột hay màng phim mỏng bám trên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản).
Tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí:
- Sắc ký khí rắn (Gas solid chromatography-GSC): Chất phân tích đƣợc hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.
- Sắc ký khí lỏng (Gas liquid chromatography-GLC): Pha tĩnh là một chất lỏng không bay hơi.
Phƣơng pháp này chỉ đƣợc giới hạn với những chất có thể bốc hơi mà không bị phân hủy hay là trong khi phân hủy cho sản phẩm phân hủy xác định
dƣới thể hơi.
Có 2 loại kỹ thuật phân tích:
Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phƣơng pháp này khó tách hoàn toàn.
Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phƣơng pháp này tiêu tốn thời gian nhƣng triệt để.
Máy sắc ký (Hình 1.9)
Hai bộ phận quan trọng trong máy sắc ký là hệ thống cột tách và detectơ.
Nguyên tắc hoạt động
Nhờ có khí mang chứa trong bơm khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Qúa trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detectơ, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả (bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi).
Hình 1.9. Sơ đồ thu gọn của thiết bị sắc kí khí
Trên sắc kí đồ nhận đƣợc, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là pic. Thời gian lƣu của pic là đại lƣợng đặc trƣng cho chất cần phân tích. Diện
tích pic là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
Hình 1.10. Hình ảnh sắc kí đồ
Sắc kí đồ (Hình 1.10) là tập hợp tất cả các pic, mỗi pic đại diện cho mỗi chất. Dựa vào thời gian lƣu ta có thể xác định đƣợc tên chất và đo diện tích mỗi pic ta xác định đƣợc thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.
c. Phương pháp khối phổ (MS)
- Phƣơng pháp khối phổ là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trƣờng hay từ trƣờng nhất định.
- Máy khối phổ là thiết bị dùng cho phƣơng pháp phổ khối, cho ra phổ khối lƣợng của một mẫu, để tìm ra thành phần của nó.
- Theo tính năng của bộ ghi, ngƣời ta chia các máy khối phổ thành hai loại:
+ Máy khối phổ ký ghi bằng hình ảnh: tín hiệu phổ đƣợc ghi bằng kính ảnh ở dạng vạch có độ đen khác nhau.
+ Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm ion đƣợc ghi dƣới dạng xung