6. Cấu trúc của luận văn
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
2.2.1. Hóa chất
- Dung môi hữu cơ: n-hexan, diclometan, etyl axetat, etanol.
- Hóa chất vô cơ: dung dịch HNO3, dung dịch NaOH, NaCl khan, nƣớc cất. Các hóa chất đều có nguồn gốc Trung Quốc.
Một số hóa chất khác: cao thịt, peptone, agar.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị
- Bộ chiết soxhlet, bình tam giác 250 ml, bình đo tỷ trọng 50 ml, ống đong 50ml, ống đong 100 ml, cốc thủy tinh loại 500 ml, cốc thủy tinh loại 1 lít; pipet, phễu Buchner, chén sứ có nắp đậy, giấy lọc, màng bọc thực phẩm.
- Tủ sấy, tủ hút ẩm, lò nung, cân phân tích điện tử, bếp đun cách thủy, bếp điện, nhiệt kế.
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy đo sắc kí khí kết hợp với khối phổ GC – MS, máy cô quay chân không.
- Buồng cấy vô trùng, tủ ấm, nồi hấp tiệt trùng, que cấy, que tra, đĩa petry, máy đo pH.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Xác định một số chỉ số hóa lý 2.3.1. Xác định một số chỉ số hóa lý
a. Xác định độ ẩm
* Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ẩm 100oC đến khối lƣợng không đổi. * Cơ sở của phƣơng pháp
Nguyên liệu ẩm có thể xem nhƣ hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nƣớc tự do: m = mo + w
Độ ẩm tƣơng đối (ω) của nguyên liệu ẩm: Là tỉ số của khối lƣợng nƣớc trên khối lƣợng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:
ω= w m .100 = w m0+w .100 = (m+m1)-m2 m .100 (2.1)
Trong đó,
m: Khối lƣợng chung của nguyên liệu
mo: Khối lƣợng của chất khô tuyệt đối (không có ẩm) (g) w: Khối lƣợng nƣớc chứa trong nguyên liệu (g)
m1: Khối lƣợng chén sứ (g)
m2: Khối lƣợng nguyên liệu và chén sứ sau khi sấy (g) Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của các mẫu
ω (%)= ∑ (2.2)
* Cách tiến hành
Để xác định độ ẩm của lá, nhân quả bàng chúng tôi tiến hành nhƣ sau: Chuẩn bị sẵn 10 chén sứ sạch, đánh dấu và để trong tủ sấy đến nhiệt độ 100oC, sau khi sấy xong đặt chén sứ trong bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng, cân các chén sứ ta đƣợc khối lƣợng m1.
Cho vào 5 chén sứ đầu tiên m gam bột lá, 5 chén sứ tiếp theo m gam bột nhân quả. Sau đó tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100oC, cứ sau 2 giờ lại lấy ra cân, cứ nhƣ vậy cho đến khi khối lƣợng m2 của chén và mẫu không đổi thì cho vào bình hút ẩm để làm nguội.
b. Xác định hàm lượng tro
Để xác định hàm lƣợng hữu cơ tổng và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động thựcvật ngƣời ta dùng phƣơng pháp tro hóa mẫu .
Tro là khối lƣợng còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.
* Dụng cụ: Cốc sứ, bình hút ẩm, cân phân tích, lò nung. * Tiến hành:
- Các mẫu sau khi đƣợc xác định độ ẩm tiếp tục đƣợc đem đi tro hóa. Đem mẫu đi than hóa trên bếp điện và cho vào tủ nung ở 2000
C trong khoảng 2h, tiếp tục nâng nhiệt độ lên 5000C tro hóa mẫu trong thời gian 8h cho đến
khi toàn bộ biến thành tro màu trắng xám. Hàm lƣợng tro đƣợc tính bằng công thức:
T % = .100 (2.3)
Trong đó:
m: là khối lƣợng của mẫu nguyên liệu (g) m1: là khối lƣợng của chén sứ
m3: là khối lƣợng của chén sứ và lá (nhân quả bàng) sau khi tro hóa (t0C = 5000C)
T(%): hàm lƣợng tro
Ttrung bình % = ∑ (2.4)
c. Xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS
Mẫu sau khi tro hóa đƣợc hòa tan bằng dung dịch HNO3 1N và định mức lên 50 ml. Lọc 2 lần để loại cặn không tan sau khi tro hóa, thu đƣợc dung dịch trong suốt rồi chuyển vào ống chứa mẫu đem xác định hàm lƣợng kim loại bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng II, số 2- Ngô Quyền- Đà Nẵng (Hình 2.3).
2.3.2. Khảo sát các điều kiện chiết thích hợp
a. Khảo sát thời gian chiết thích hợp
Hiệu suất chiết soxhlet các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thƣờng hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại.
Cân một lƣợng khoảng 10 gam bột nguyên liệu bột lá bàng (nhân bàng), gói kỹ trong giấy lọc, sau đó cho một lƣợng dung môi xác định V ml nhƣ nhau vào bình. Tiến hành chiết soxhlet với nhiệt độ tùy thuộc vào dung môi. Tiến hành chiết soxhlet trong các khoảng thời gian khác nhau.
Sau đó tính khối lƣợng riêng của dịch chiết thu đƣợc. Chọn thời gian chiết soxhlet thích hợp.
b. Hiệu quả chiết bằng các dung môi
Từ kết quả khảo sát thời gian chiết thích hợp. So sánh các giá trị khối lƣợng riêng của các dịch chiết với nhau để tìm dung môi có khả năng chiết để thu đƣợc khối lƣợng riêng lớn nhất.
2.3.3. Phƣơng pháp tách chất
Dung môi chiết tách: n-hexan, diclometan, etyl axetat, etanol.
Quy trình chiết tách: chiết bằng phƣơng pháp chiết soxhlet với các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat, etanol.
Cân 10 gam bột nguyên liệu cần chiết soxhlet gói vào giấy lọc, đƣa vào hốc chiết. Lắp bộ chiết soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lƣu (Hình 2.4). Lấy 150 ml dung môi n-hexan cho vào bình cầu, tiến hành chiết soxhlet ở 80oC, dung môi bốc hơi từng phần đƣợc ngƣng tụ nhỏ vào chất đƣợc chiết đựng trong túi giấy lọc và sau đó chảy ngƣợc vào bình cầu chiết soxhlet trong các khoảng thời gian 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ. Chọn thời gian chiết thích hợp. Lấy dịch chiết đo GC-MS.
Hình 2.4. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
Đối với các dung môi còn lại ta cũng tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với dung môi n-hexan nhƣng ở nhiệt độ khác nhau, đối với diclometan chiết ở 50o C, etylaxetat ở 87oC, etanol ở 88oC .
2.3.4. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học
Thành phần hóa học của dịch chiết lá và nhân quả bàng trong các dung môi n-hexan, điclometan, etylaxetat, etanol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS .
Phổ đƣợc ghi trên máy GC-MS 7890A/5975C, Aligent technology, Mỹ. Tại trung tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn-đo lƣờng- Chất lƣợng khu vực II Đà Nẵng (Hình 2.5)
Trong đó hệ GC có cột tách mao quản Elite 35MS, kích thƣớc 30m x 250μm x 0.25μm, khí mang He, kiểu chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 2800 C, áp suất dòng khí mang 7,6522 psi, tỷ lệ chia dòng 10:1.
2.3.5. Phƣơng pháp thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng nhân quả bàng
Dịch chiết thu đƣợc trong dung môi n–hexan, etyl axetat, diclometan, etanol của lá, nhân quả bàng đem cô quay đuổi dung môi thu đƣợc cao chiết.
Đem các cao chiết này đi thử hoạt tính sinh học, tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật tại phòng thí nghiệm khoa sinh học tại trƣờng Đại học sƣ phạm Đà Nẵng.
Để thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng, tiến hành thử nghiệm trên 2 loại vi khuẩn B.subtilis (Gram dƣơng) và E.coli
(Gram âm).
a. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
* Thành phần môi trường
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn đƣợc mô tả ở Bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
STT Hóa chất Hàm lƣợng
1 cao thịt 5g
2 peptone 10g
3 NaCl 10g
4 Agar 20g
* Cách pha chế môi trường
Hòa tan 3 thành phần: cao thịt, peptone, NaCl trong nƣớc cất, định mức đến 1 lít , điều chỉnh pH=6.8, sau đó cho agar vào và khuấy đều. Đun sôi để hòa tan hoàn toàn các thành phần trên trong lò vi sóng. Hấp hỗn hợp sau khi
đun sôi ở 119o
C trong 25 phút trong nồi hấp tiệt trùng. Sau khi hấp để nguội 45-50oC,đổ vào mỗi đĩa petri 30ml hỗn hợp trên trong tủ cấy vô trùng và để cho môi trƣờng đông lại.
* Cấy vi khuẩn lên môi trường
Sau khi môi trƣờng nuôi cấy trên đĩa petri đông lại. Tiến hành lần lƣợt các bƣớc sau (lƣu ý phải bật đèn UV trong phòng nuôi cấy 30 phút để vô trùng vi khuẩn trƣớc khi cấy vi khuẩn lên môi trƣờng):
- Tiến hành đục lỗ trên đĩa petry (3 lỗ/1đĩa).
- Cấy lần lƣợt các chuẩn vi khủng E.coli và B.subtilis lên các đĩa petry có chứa môi trƣờng nuôi cấy 2μl/đĩa, đánh dấu các đĩa đối với từng loại vi khuẩn
- Dùng que trang trải đều vi khuẩn lên trên mặt đĩa.
b. Cách tiến hành thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng
Dịch chiết lá và nhân quả bàng đối với các dung môi có thể có khả năng kháng khuẩn nên để thấy đƣợc khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá hoặc nhân quả bàng đối với hai chủng E.coli và B.subtilis mà không phải của dung môi ta tiến hành thử nghiệm với các bƣớc sau:
- Lỗ (1) để nguyên để so sánh
- Lỗ (2) nhỏ dung môi tƣơng ứng với dung môi dùng để chiết. - Lỗ (3) nhỏ dịch chiết với thể tích 0,2 ml/1lỗ.
Sau đó ủ các đĩa petry trên tại nhiệt độ 37o
C trong vòng 48 giờ trong phòng nuôi cấy. Quan sát kết quả thu đƣợc, chụp hình tất cả các đĩa với từng loại vi khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng đối với từng loại dung môi, đo vòng vô khuẩn (đƣờng kính vòng kháng khuẩn) đối với các mẫu có hoạt tính kháng khuẩn.
2.4. SƠ ĐỒ QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU
Để thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ ở Hình 2.6
Hình 2.6. Sơ đồ thực nghiệm Xác định thành phần hóa học (đo GC-MS) Dịch chiết n-hexan (lá, nhân quả) Thử khả năng kháng khuẩn Dịch chiết diclometan (lá, nhân quả) Dịch chiết etylaxetat (lá, nhân quả) Dịch chiết etanol (lá, nhân quả) n- hexan (lá, nhân quả) Xác định độ ẩm Xác định hàm lƣợng tro Xác định hàm lƣợng kim loại diclometan (lá, nhân quả) etylaxetat (lá, nhân quả) etanol (lá, nhân quả) Nguyên liệu cây bàng
(lá, nhân quả )
Chiết soxhlet với các dung môi Dạng bột (lá, nhân quả)
bàng khô
Xác định thông số hóa lý (lá, nhân quả khô)
Xử lý
Khảo sát điều kiện chiết thích hợp
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ HÓA LÝ 3.1.1. Xác định độ ẩm 3.1.1. Xác định độ ẩm
Mẫu dùng để xác định độ ẩm là mẫu lá (nhân quả) bàng khô đã xay mịn. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu. Kết quả xác định độ ẩm đƣợc trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm (%) trong lá bàng khô
STT m(g) m1 (g) m2(g) W(%) 1 5,004 35,732 40,495 4,816 2 5,001 32,487 37,212 5,519 3 5,003 34,560 39,272 5,816 4 5,001 36,412 41,175 4,759 5 5,004 37,325 42,026 6,055 Độ ẩm trung bình 5,393
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm (%) trong nhân quả bàng khô
STT m(g) m1(g) m2(g) W(%) 1 5,001 53,604 58,226 7,578 2 5,003 58,287 62,942 6,956 3 5,004 54,824 59,537 5,809 4 5,006 62,898 67,586 6,352 5 5,001 55,161 59,816 6,919 Độ ẩm trung bình 6,723
Trong đó
m1: Khối lƣợng cốc (g)
m: Khối lƣợng mẫu bàng khô ban đầu (g) m2:Khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy (g) W: Độ ẩm của mỗi mẫu (%)
Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của lá bàng khô là 5,393 %, của nhân quả bàng khô là 6,723% đây là độ ẩm tƣơng đối thấp. Vì vậy có thể bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài nhƣng vẫn giữ đƣợc chất lƣợng tốt của nguyên liệu, tránh sự xâm nhập của vi sinh vật và nấm mốc.
3.1.2 Xác định hàm lƣợng tro
Các mẫu sau khi xác định độ ẩm đem nung trong lò nung ở 500-5500C để xác định hàm lƣợng tro. Hàm lƣợng tro đƣợc lấy trung bình của 5 mẫu. Mẫu xác định hàm lƣợng tro đƣợc thể hiện ở Hình 3.1 và Hình 3.2.
Hình 3.1. Mẫu xác định hàm lượng tro trong lá bàng
Kết quả xác định hàm lƣợng tro đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3 và Bảng 3.4
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng tro trong lá bàng khô
STT m(g) m1(g) m3(g) T (%) 1 5,004 35,732 36,304 11,431 2 5,001 32,487 33,043 11,118 3 5,003 34,560 35,078 10,354 4 5,001 36,412 36,952 10,798 5 5,004 37,325 37,788 9,256 Hàm lƣợng tro trung bình 10,591
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng tro trong nhân quả bàng khô
STT m(g) m1(g) m3(g) T(%) 1 5,001 53,604 53,811 4,139 2 5,003 58,287 58,461 3,478 3 5,004 54,824 55,032 4,153 4 5,006 62,898 63,063 3,296 5 5,001 55,161 55,332 3,419 Hàm lƣợng tro trung bình 3,697 Trong đó m1: Khối lƣợng cốc (g)
m: Khối lƣợng mẫu bàng khô ban đầu (g) m3:Khối lƣợng cốc và mẫu sau khi nung (g) T: Hàm lƣợng tro của mỗi mẫu (%)
Nhận xét:
Hàm lƣợng tro trung bình trong lá bàng là 10,591%, trong nhân quả bàng là 3,697 %. Hàm tro trong lá cao hơn nhiều so với trong nhân quả bàng là do trong lá có chứa nhiều kim loại hoặc muối của một số kim loại. Đây là hàm lƣợng các chất vô cơ không bay hơi tồn tại trong cây bàng.
3.1.3. Xác định hàm lƣợng một số kim loại nặng
lên 50 ml. Lọc 2 lần để loại cặn không tan sau khi tro hóa, thu đƣợc dung dịch trong suốt rồi chuyển vào ống chứa mẫu đem xác định hàm lƣợng kim loại bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng II, số 2- Ngô Quyền- Đà Nẵng. Kết quả xác định hàm lƣợng kim loại nặng đƣợc trình bày trong Bảng 3.5
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng
Mẫu Tên Kim loại Phƣơng pháp thử Kết quả Hàm lƣợng kim loại cho phép (mg/kg) [2] Bột tro lá bàng Pb TCVN 6193:1996 0,785 2,0000 Cu TCVN 6193:1996 8,439 150,0000 Zn TCVN 6193:1996 18,264 40,0000 Hg TCVN 6193:1996 KPH 0,0500 Bột tro nhân quả bàng Pb TCVN 6193:1996 0,086 0,100 Cu TCVN 6193:1996 4,951 30,0000 Zn TCVN 6193:1996 36,825 40,0000 Hg TCVN 6193:1996 KPH 0,0500 Nhận xét:
Căn cứ vào quyết định của Bộ Y tế số 46/2007/QD-BYT ngày 19-12- 2007 về việc ban hành danh mục „„giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm”. Đối chiếu với hàm lƣợng kim loại nặng cho phép trong chè và các sản phẩm từ chè đối với lá, quả đối với nhân quả bàng và kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy hàm lƣợng kim loại nặng trong lá, nhân quả bàng là hàm lƣợng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU MÔI KHÁC NHAU
3.2.1. Khảo sát thời gian chiết với dung môi n-hexan
10 g. Tiến hành chiết soxhlet với 150 ml dung môi n-hexan (khối lƣợng riêng d=0,6508 g/ml) ở 80oC trong các khoảng thời gian là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ. Đối với mỗi mẫu ta thu hồi dung môi còn lại thể tích dịch chiết là 50 ml. Cho 50 ml dịch chiết vào bình tỷ trọng loại 50 ml (đã biết khối lƣợng) để xác định khối lƣợng riêng. Trong đó:
m1: khối lƣợng bình tỷ trọng (g)
m2: khối lƣợng bình tỷ trọng và dịch chiết (g) m: khối lƣợng dịch chiết với m = m2 - m1 V: thể tích dịch chiết (ml)
d: khối lƣợng riêng dịch chiết (g/ml)
a. Kết quả khảo sát thời gian chiết của lá bàng bằng dung môi n- hexan
Kết quả khảo sát thời gian chiết của lá bàng bằng dung môi n-hexan trong các khoảng thời gian khác nhau đƣợc thể hiện ở Bảng 3.6
Bảng 3.6. Thời gian chiết với dung môi n-hexan của lá bàng
Dung môi n-hexan Thời gian (giờ) m1(g) m2(g) m(g) V(ml) d(g/ml) 2 20,571 53,142 32,571 50 0,6514 4 20,548 53,197 32,649 50 0,6530 6 20,571 53,577 33,006 50 0,6601 8 20,548 53,459 32,911 50 0,6582 10 20,565 53,177 32,612 50 0,6522
- Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy thời gian tối ƣu dùng để thu dịch chiết lá bàng trong dung môi n-hexan là 6 giờ. Với thời gian này thì khối lƣợng của