6. Cấu trúc của luận văn
2.3.5. Phƣơng pháp thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá và nhân
nhân quả bàng
Dịch chiết thu đƣợc trong dung môi n–hexan, etyl axetat, diclometan, etanol của lá, nhân quả bàng đem cô quay đuổi dung môi thu đƣợc cao chiết.
Đem các cao chiết này đi thử hoạt tính sinh học, tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật tại phòng thí nghiệm khoa sinh học tại trƣờng Đại học sƣ phạm Đà Nẵng.
Để thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng, tiến hành thử nghiệm trên 2 loại vi khuẩn B.subtilis (Gram dƣơng) và E.coli
(Gram âm).
a. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
* Thành phần môi trường
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn đƣợc mô tả ở Bảng 2.1
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
STT Hóa chất Hàm lƣợng
1 cao thịt 5g
2 peptone 10g
3 NaCl 10g
4 Agar 20g
* Cách pha chế môi trường
Hòa tan 3 thành phần: cao thịt, peptone, NaCl trong nƣớc cất, định mức đến 1 lít , điều chỉnh pH=6.8, sau đó cho agar vào và khuấy đều. Đun sôi để hòa tan hoàn toàn các thành phần trên trong lò vi sóng. Hấp hỗn hợp sau khi
đun sôi ở 119o
C trong 25 phút trong nồi hấp tiệt trùng. Sau khi hấp để nguội 45-50oC,đổ vào mỗi đĩa petri 30ml hỗn hợp trên trong tủ cấy vô trùng và để cho môi trƣờng đông lại.
* Cấy vi khuẩn lên môi trường
Sau khi môi trƣờng nuôi cấy trên đĩa petri đông lại. Tiến hành lần lƣợt các bƣớc sau (lƣu ý phải bật đèn UV trong phòng nuôi cấy 30 phút để vô trùng vi khuẩn trƣớc khi cấy vi khuẩn lên môi trƣờng):
- Tiến hành đục lỗ trên đĩa petry (3 lỗ/1đĩa).
- Cấy lần lƣợt các chuẩn vi khủng E.coli và B.subtilis lên các đĩa petry có chứa môi trƣờng nuôi cấy 2μl/đĩa, đánh dấu các đĩa đối với từng loại vi khuẩn
- Dùng que trang trải đều vi khuẩn lên trên mặt đĩa.
b. Cách tiến hành thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng
Dịch chiết lá và nhân quả bàng đối với các dung môi có thể có khả năng kháng khuẩn nên để thấy đƣợc khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá hoặc nhân quả bàng đối với hai chủng E.coli và B.subtilis mà không phải của dung môi ta tiến hành thử nghiệm với các bƣớc sau:
- Lỗ (1) để nguyên để so sánh
- Lỗ (2) nhỏ dung môi tƣơng ứng với dung môi dùng để chiết. - Lỗ (3) nhỏ dịch chiết với thể tích 0,2 ml/1lỗ.
Sau đó ủ các đĩa petry trên tại nhiệt độ 37o
C trong vòng 48 giờ trong phòng nuôi cấy. Quan sát kết quả thu đƣợc, chụp hình tất cả các đĩa với từng loại vi khuẩn của dịch chiết lá và nhân quả bàng đối với từng loại dung môi, đo vòng vô khuẩn (đƣờng kính vòng kháng khuẩn) đối với các mẫu có hoạt tính kháng khuẩn.