Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định ở
mỗi chuyên luận. Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng nước, một phần hoặc toàn bộ khối lượng nước kết tinh và lượng chất dễ bay hơi khác trong mẫu thử. Việc xác định mất khối lượng do làm khô không
được làm thay đổi tính chất lý hóa cơ bản của mẫu thử vì vậy mỗi chuyên luận riêng sẽ có những qui định cách làm khô theo một trong các phương pháp sau:
a. Trong bình hút ẩm
Tiến hành làm khô trong bình hút ẩm với những chất hút nước như
phosphor pentoxyd, silicagel vv…
b. Trong chân không
Tiến hành làm khô ở điều kiện áp suất từ 1,5-2,5 kPa có mặt chất hút
ẩm phosphor pentoxyd và ở nhiệt độ phòng.
c. Trong chân không ở điều kiện nhiệt độ xác định
Tiến hành làm khô ở điều kiện áp suất từ 1,5-2,5 kPa có mặt chất hút
ẩm phosphor pentoxyd và ở nhiệt độ qui định trọng chuyên luận riêng.
d. Trong tủ sấy ởđiều kiện nhiệt độ xác định
Tiến hành làm khô trong tủ sấy ở điều kiện nhiệt độ qui định trong chuyên luận riêng.
e. Trong chân không hoàn toàn
Tiến hành làm khô ở điều kiện áp suất không quá 0,1 kPa có mặt chất hút ẩm phosphor pentoxyd và ở nhiệt độ qui định.
Cách tiến hành: Dùng dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong thời gian 30 phút theo phương pháp và điều kiện qui định trong chuyên luận rồi cân để xác định khối lượng bì. Cân ngay vào bì này một khối lượng chính xác mẫu thử
bằng khối lượng qui định trong chuyên luận với sai số ± 10%. Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì lượng mẫu thử được được dàn mỏng thành lớp độ
dày không quá 5 mm. Nếu mẫu thử có kích thước lớn thì phải nghiền nhanh tới kích thước dưới 2 mm trước khi cân. Tiến hành làm khô trong điều kiện qui định của chuyên luận. Nếu dùng phương pháp sấy thì nhiệt độ chỉ được phép chênh lệch ± 2oC so với nhiệt độ qui định. Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay. Nếu chuyên luận không qui định thời gian làm khô có nghĩa là phải làm khô đến khối lượng không đổi, tức là sự chênh lệch của khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy hoặc 6 giờ trong bình hút ẩm so với lần sấy trước không quá 0,5 mg.
Nếu mẫu thử bị chảy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ qui định thì trước khi đưa lên nhiệt độ đó cần duy trì từ 1 đến 2 giờ ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mẫu thử từ 5oC đến 10oC.
Nếu mẫu thử là dược liệu, khi chuyên luận riêng không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì tiến hành sấy trong tủ sấy ở áp suất thường. Dược liệu phải
được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm, lượng đem thử từ
2 g đến 5 g, chiều dày mẫu thử đem sấy là 5 mm và không quá 10 mm đối với dược liệu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng [1].
1.4.2. Phương pháp xác định tro toàn phần
cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450oC tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Hợp dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450oC đến khi khối lượng không đổi. tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí [1].
1.4.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp xác định nồng độ của nguyên tố trong một chất bằng cách đo độ hấp thụ bức xạ bởi hơi nguyên tử tự do của nguyên tố đó được hóa hơi từ chất thử. Việc định lượng
được tiến hành ở bước sóng của một trong những vạch hấp thụ của một nguyên tố cần xác định.
Thiết bị: Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử chủ yếu bao gồm nguồn bức xạ, bộ phận hóa hơi nguyên tử của nguyên tố cần xác định (ngọn lửa, lò graphit v.v…), bộđơn sắc hóa và bộ phận phát hiện.
Phương pháp đưa các chất vào để phân tích phụ thuộc vào kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu. Nếu nguyên tử hóa bằng ngọn lửa, các chất sẽ được hóa hơi và nước là dung môi được chọn để chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử, tuy nhiên các dung môi hữu cơ có thểđược sử dụng nếu đảm bảo chắc chắn là dung môi không ảnh hưởng đến độ ổn định của ngọn lửa. Nếu nguyên tử hóa không ngọn lửa (sử dụng lò graphit), các chất đưa vào có thể được hòa tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ.
quang phổ, ví dụ, phương pháp hóa hơi lạnh cho thủy ngân hoặc một số
hydrid. Đối với thủy ngân, nguyên tử được hóa hơi bằng sự khử hóa học và hơi nguyên tử được dẫn bằng một dòng khí trơ đến một cốc đo được đặt trong
đường quang trục máy. Các hydrid được dẫn bằng hỗn hợp khí đốt hoặc bằng khí trơđến một cốc đo đã được đốt nóng, tại đây chúng được nguyên tử hóa.
Phương pháp tiến hành: Vận hành máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
theo các chỉ dẫn của hãng sản xuất máy về cách đặt bước sóng quy định. Đưa dung dịch mẫu trắng vào buồng hóa hơi nguyên tử và hiệu chỉnh kết quả sao cho độ hấp thụ đọc được trên máy bằng “0”. Đưa dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ lớn nhất vào máy và hiệu chỉnh độ nhạy đểđạt được một phép đọc
độ hấp thụ thích hợp.
Việc định lượng được thực hiện bằng cách so sánh với các dung dịch chuẩn đối chiếu đã biết nồng độ của nguyên tố cần xác định bằng phương pháp xác định trực tiếp (phương pháp 1) hoặc bằng phương pháp thêm chuẩn (phương pháp 2).
Phương pháp 1: Phương pháp xác định trực tiếp
Chuẩn bị dung dịch chất thử (dung dịch thử) như được mô tả trong chuyên luận riêng sao cho nồng độ của nguyên tố cần xác định nằm trong khoảng nồng độ của các dung dịch chuẩn. Chuẩn bị không ít hơn ba dung dịch chuẩn của nguyên tố cần xác định có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích. Bất kỳ thuốc thử
nào được dùng trong việc chuẩn bị các dung dịch thử đều phải được thêm vào các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu trắng ở cùng nồng độ. Đưa dung dịch mẫu trắng vào máy, điều chỉnh tín hiệu đọc được về “0”. Đưa lần lược dung dịch thử và chuẩn vào máy, ít nhất mỗi dung dịch làm ba lần, ghi lại kết quả đọc ổn định. Rửa máy bằng dung dịch mẫu trắng sau mỗi lần đo cho đến khi
tín hiệu trở về giá trị đọc ban đầu của mẫu trắng. Nếu sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa, lò graphit phải được đốt giữa các lần phân tích. Từ cường độ vạch hấp thụ đọc được của các dung dịch chuẩn, thiết lập
đường chuẩn biểu thị sự thay đổi cường độ vạch hấp thụ theo nồng độ nguyên tố cần xác định và từ đường chuẩn này xác định nồng độ nguyên tố trong dung dịch thử.
Phương pháp 2: Phương pháp thêm chuẩn
Cho vào ít nhất ba bình định mức có dung tích như nhau, các thể tích bằng nhau của dung dịch chất đem thử (dung dịch thử) được chuẩn bị như chỉ
dẫn trong các chuyên luận. Thêm vào tất cả các bình, trừ một bình, các thể
tích lớn dần của dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết của nguyên tố cần xác
định sao cho nồng độ của nguyên tố cần xác định trong các bình đều nằm trong khoảng tuyến tính giữa nồng độ và cường độ hấp thụ. Pha loãng các dung dịch có chứa trong bình đến vừa đủ thể tích bằng dung môi.
Đưa dung dịch mẫu trắng vào máy, điều chỉnh tín hiệu đọc về “0”. Đưa lần lược dung dịch thử và chuẩn vào máy, ít nhất mỗi dung dịch làm ba lần, ghi lại kết quả đọc ổn định. Rửa máy bằng dung dịch mẫu trắng sau mỗi lần
đo cho đến khi tín hiệu trở về giá trịđọc ban đầu của mẫu trắng. Nếu sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa, lò graphit phải đốt lại giữa các lần phân tích.
Tính phương trình hồi quy của đường thẳng chuẩn bằng cách dùng phương pháp bình phương tối thiểu và xác định từ đường thẳng này nồng độ
của nguyên tố cần xác định trong dung dịch thử. Một cách khác, vẽ đồ thị
biễu diễn sự liên quan giữa giá trị đọc được và lượng thêm vào của nguyên tố
cần xác định. Nối các điểm trên đồ thị và kéo dài về phía trái cho đến khi nó gặp trục nồng độ. Khoảng cách giữa điểm này và điểm giao nhau của trục tọa
1.4.4. Phương pháp chiết xuất dược liệu
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết.
Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là: - Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
- Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi.
- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
Dược liệu có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết. Kích thước của bột dược liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả
của quá trình chiết.
Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau: Chiết ở nhiệt độ
thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường), nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng) hay chiết với thiết bị như soxhlet… tùy yêu cầu,
điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp.
Trong phương pháp ngâm, dược liệu được ngâm trong một lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu.
Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là một quá trình chiết ngược dòng với nồng độ
dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Tùy từng loại hoạt chất mà chọn dung môi chiết cho thích hợp. Về
nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, ethanol thường hay dùng vì đây là dung môi thông dụng, có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong ethanol sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết xuất cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết xuất mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả chiết xuất.
1.4.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng đểđịnh tính, thử
tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha
tĩnh là chất hấp phụđược chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu
được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế
hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
b a Rf =
Trong đó:
a: Khoảng cách di chuyển của chất phân tích.
b: Khoảng cách di chuyển của dung môi tính từđiểm chấm mẫu. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi, vị
trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tương đối Rr. Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu được sắc ký trong cùng điều kiện và trong cùng bản mỏng với mẫu thử:
c a Rr =
Trong đó:
a: Khoảng cách di chuyển của chất phân tích.
c: Khoảng cách di chuyển của chất chuẩn đối chiếu. Giá trị Rr có thể lớn hơn hay nhỏ hơn 1.
Cách tiến hành:
Dụng cụ:
- Bình triển khai sắc ký, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín.
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.
- Dụng cụđể phun thuốc thử.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
- Tủ hút hơi độc.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Một máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l µl, 2 µl, 5 µl, 10 µl đến 20 µl, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.
Trường hợp phòng thí nghiệm không có điều kiện trang bị các loại bản mỏng tráng sẵn thì tự chuẩn bị lấy bản mỏng với các dụng cụ sau đây: