Sắc ký cột là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở hai đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp. Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổđiển dùng trong điều chế các chất và sắc ký cột hiện đại thường dùng trong phân tích
như sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí... ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển. Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách và phân lập các chất.
Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng các cột thủy tinh
đường kính 1-5 cm dài 30-100 cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ 15-300 µm. Kích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ
dàng nhưng hiệu năng tách kém. Với vật liệu nhồi cột là silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15-40 µm), loại vừa (40-63 µm) và loại thô (63-200 µm). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả năng tách của hệ thống. Tỉ lệ
mẫu/pha tĩnh thường là 1/30-1/100 hay hơn. Trong 1 vài kỹ thuật, tỉ lệ này có thể tăng tới 1/10.
Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp. Dung môi có các chất
được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ phận hứng phân đoạn. Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để
thu được chất tinh khiết. Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất.
Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thủy tĩnh. Với cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng đến kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán. Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn. Để khắc phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến đã
được sử dụng giúp giảm thời gian phân tách. Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm. Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản
sắc ký cột nhanh và sắc ký cột chân không. Cả hai đều sử dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu. Sắc ký cột nhanh sử dụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn sắc ký cột chân không sử dụng áp suất âm ở cuối cột.
Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu và đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu.