Tiến hành sắc ký cột với cao chiết n-hexane (5,0190 g), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 20 mm x 600 mm, hạt nhồi là silica gel G cỡ hạt 63-200 μm Merck. Hệ dung môi giải ly n-hexane – ethyl acetate (độ phân cực tăng dần từ
0% đến 100% ethyl acetate) (xem Hình 2.15).
Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ cho các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả gộp thành 7 phân
đoạn (H1-H7) được nêu trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các phân đoạn cao chiết n-hexane
Phân đoạn Các lọđược gộp Ký hiệu Khối lượng (mg)
1 1 - 18 H1 5,2 2 19 - 38 H2 500,3 3 39 - 48 H3 3332,3 4 49 - 59 H4 88,7 5 60 - 88 H5 137,7 6 89 - 101 H6 56,5 7 102 -120 H7 6,4 a. Tiến hành khảo sát phân đoạn H2 (500,3 mg) Tiến hành sắc ký cột với phân đoạn H2 (500,3 mg), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 20 mm x 600 mm, hạt nhồi là silica gel G cỡ hạt 63-200 μm Merck và hệ dung môi giải ly n-hexane – ethyl acetate (90:10), thu được 77 lọ (10 ml/lọ). Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ có các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả có 6 phân đoạn (H2.1-H2.6) như sau: H2.1 (lọ 1-16), H2.2 (lọ 17-26), H2.3 (lọ 27-37), H2.4 (lọ 38-50), H2.5 (lọ 51-62), H2.6 (lọ 63-77). Trong đó phân đoạn H2.5 chỉ cho một vết rõ, thu được hợp chất ký hiệu QDDH2.5 (100,4 mg; dạng dầu, màu vàng nhạt) theo sơ đồ phân lập các hợp chất từ
Hình 2.16. Sơđồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H2
b. Tiến hành khảo sát phân đoạn H3 (3332,3 mg)
Tiến hành sắc ký cột với phân đoạn H3 (3332,3 mg), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 20 mm x 600 mm, hạt nhồi là silica gel G cỡ hạt 63-200
μm Merck và hệ dung môi giải ly n-hexane – ethyl acetate (90:10), thu
được 78 lọ (10 ml/lọ). Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ có các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả có 6 phân đoạn (H3.1-H3.6) như sau: H3.1 (lọ 1-18), H3.2 (lọ 19-28), H3.3 (lọ 29-45), H3.4 (lọ 46-59), H3.5 (lọ 60-68), H2.6 (lọ 69-78). Trong
đó phân đoạn H3.1 chỉ cho một vết rõ, thu được hợp chất ký hiệu QDDH3.1 (255,9 mg, dạng dầu, màu vàng nhạt) theo sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H3 (xem hình 2.17). H2 (500,3 mg) H2.1 (12,4 mg) H2.2 (8,9 mg) H2.3 (78,6 mg) H2.4 (15,2 mg) QDDH2.5 (100,4 mg) H2.6 (1,4mg) Sắc ký cột, hệ dung môi giải ly n-hexane-ethyl acetate (90:10)
Hình 2.17. Sơđồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H3
Để xác định cấu trúc các hợp chất QDDH2.5 và QDDH3.1 đã phân lập được, tiến hành phân tích và ghi các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC trên máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR SPECTROMETER) Model DRX500 (tần số 500 MHz) BRUCKER AVANCE. H3 (3332,3 mg) QDDH3.1 (255,9 mg) H3.2 967,7 mg) H3.3 (1104,5 mg) H3.4 (279,2 mg) H3.5 (75,0 mg) H3.6 (219,8 mg) Sắc ký cột, hệ dung môi giải ly n-hexane-ethyl acetate (90:10)
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 3.1.1. Độẩm
Tiến hành xác định độẩm của mẫu quả dứa dại khô theo mục 2.4.1. Kết quảđược nêu trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu quả dứa dại khô STT Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) Khối lượng mẫu sau khi sấy (g) Khối lượng nước trong mẫu (g) Độẩm (%) 1 2,0012 1,8769 0,1243 6,21 2 2,0006 1,8770 0,1236 6,18 3 2,0009 1,8777 0,1232 6,16 4 2,0010 1,8761 0,1249 6,24 5 2,0006 1,8751 0,1255 6,27 Độẩm trung bình 6,21
Nhận xét: Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn. Ðể
bảo quản tốt, dược liệu cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an toàn. Quả dứa dại khô chưa có quy định độ ẩm an toàn. Tuy nhiên, so sánh với độ ẩm an
toàn của một số dược liệu (dạng quả) trong khoảng từ 9% đến 12% (theo Dược điển Việt Nam IV) thì mẫu quả dứa dại khô có độ ẩm xác định được là
đạt yêu cầu. Với giá trị độ ẩm trung bình 6,21% và điều kiện bảo quản thích hợp có thể bảo quản mẫu trong thời gian dài mà không bị hư hỏng, giữ được chất lượng trong quá trình làm thử nghiệm.
3.1.2. Tro toàn phần
Tiến hành xác định tro toàn phần trong mẫu quả dứa dại khô theo mục 2.4.2. Kết quả được nêu trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xác định tro toàn phần trong mẫu quả dứa dại khô
STT Khối lượng mẫu (g) Khối lượng tro (g) Tỉ lệ tro (%)
1 2,0011 0,0752 3,76
2 2,0021 0,0750 3,75
3 2,0006 0,0746 3.73 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trung bình 3,75
Nhận xét: Hàm lượng tro trong mẫu nguyên liệu quả dứa dại khô, sau khi nung trung bình là 3,75%, rất thấp so hàm lượng tro toàn phần của một số
dược liệu (dạng quả) theo Dược điển Việt Nam IV. Với giá trị này, cho thấy hàm lượng kim loại trong quả dứa dại rất ít.
3.1.3. Hàm lượng kim loại nặng
Tiến hành xác định hàm lượng kim loại nặng trong mẫu quả dứa dại khô theo mục 2.4.3. Kết quảđược nêu trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng trong mẫu quả dứa dại khô STT Kim loại Kết quảđo được (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Cd KPH(<0,05) 1,00 2 As 0,09 1,00 3 Hg KPH(<0,05) 0,05 4 Pb 0,08 2,00 5 Cu 11,80 30,00 6 Zn 10,00 40,00
Nhận xét: Thành phần kim loại nặng có trong quả dứa dại khô tương đối thấp. Kết quả so sánh với giới hạn kim loại nặng trong các loại rau quả khô (QCVN 8-2:2011/BYT-Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm) thì hàm lượng các kim loại nặng trong quả dứa dại khô nằm trong giới hạn cho phép. Đây cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá việc sử dụng quả dứa dại dùng làm dược liệu an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người [2].
3.2. KẾT QUẢ TRÍCH LY CÁC LOẠI CAO
Tiến hành trích ly các loại cao của quả dứa dại khô theo mục 2.5. Kết quả chiết xuất được nêu trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lượng các loại cao
STT Loại cao Ký hiệu Khối lượng (g) Hàm lượng (%) 1 n-Hexane H 37,3927 2,077 2 Ethyl acetate EA 12,3181 0,684 3 Dichloromethane DCM 0,0900 0,005
Nhận xét: Hàm lượng chiết được từ 1,8 kg quả dứa dại khô của 3 dung môi n-hexane, ethyl acetate và dichloromethane là 2,766%. Trong ba loại cao chiết từ quả dứa dại khô, cao chiết n-hexane có hàm lượng cao nhất (2,077%), cao chiết dichloromethane có hàm lượng rất thấp (0,005%), chứng tỏ trong quả dứa dại có chứa lượng chất không phân cực tương đối lớn.
3.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC DỊCH CHIẾT 3.3.1. Thành phần hóa học dịch chiết n-hexane
Dịch chiết n-hexane của quả dứa dại được phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ, kết quả phân tích được thể hiện trên sắc ký đồ (xem Hình 3.1).
Bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), so sánh với thư viện phổ NIST đã định danh được một số cấu tử trong dịch chiết n-hexane, được nêu trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Một số cấu tử trong dịch chiết n-hexane
STT Thời gian lưu, phút Tên hợp chất % Diện tích píc 1 5,669 Tetradecane 0,10 2 5,796 Vanillin 0,24 3 6,734 Pentadecane 0,09
4 7,700 Benzoic acid, 4-hydroxy-3-methoxy- 0,10 5 9,497 Benzaldehyde, 4-hydroxy-3,5-dimethoxy- 0,13 6 11,780 Tetradecanoic acid 0,05 7 12,114 Benzyl Benzoate 0,08 8 15,093 Pentadecanoic acid 0,05 9 16,393 Pentadecanoic acid, ethyl ester 0,05 10 17,718 Hexadecanoic acid, methyl ester 0,05 11 20,517 n-Hexadecanoic acid 15,72 12 21,134 Hexadecanoic acid, ethyl ester 11,36 13 26,519 9,12-Octadecadienoic acid, ethyl ester 32,73 14 26,592 Ethyl Oleate 11,80 15 26,689 Octadecanoic acid 3,03 16 26,835 Octadecanoic acid, ethyl ester 5,60
17 29,971 1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono (2- ethylhexyl) ester 0,34 18 31,477 Heneicosane 0,45 19 37,313 Vitamin E 0,11 20 37,574 2,6-Bis(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7- dioxabicyclo(3.3.0)octane 0,23 21 40,315 gamma.-Sitosterol 0,69 22 42,372 Stigmast-4-en-3-one 0,11
Nhận xét: Kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexane quả dứa dại cho thấy: Trong dịch chiết n-hexane có 22 cấu tử được phát hiện, trong đó chủ yếu là 9,12-octadecadienoic acid, ethyl ester (32,73%), n-hexadecanoic acid (15,72%), ethyl oleate (11,80%), hexadecanoic acid, ethyl ester (11,36%), octadecanoic acid, ethyl ester (5,60%), octadecanoic acid (3,03%) và các cấu tử còn lại chiếm tỷ lệ rất thấp. Trong đó có một số
cấu tử có hoạt tính sinh học như: vanillin (chống oxy hóa, chống co giật), tetradecanoic acid (chống ung thư), n-hexadecanoic acid (ức chế enzyme), octadecanoic acid (kháng virut, kháng viêm), vitamin E (chống oxy hóa), 1,2-bis (3,4-methylenedioxyphenyl) -3,7-dioxabicyclo(3.3.0) octane (chống oxy hóa, giảm cholesterol trong huyết tương), gamma-sitosterol (hạ đường huyết, hiệu quả trong điều trị tiểu đường tuýp II).
3.3.2. Thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate
Dịch chiết ethyl acetate của quả dứa dại được phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ, kết quả phân tích được thể hiện trên sắc ký đồ (xem Hình 3.2).
Bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), so sánh với thư viện phổ NIST đã định danh được một số cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate,
được nêu trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Một số cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate
STT Thời gian
lưu, phút Tên hợp chất
% Diện tích píc 1 3,904 Ethyl hydrogen succinate 1,86 2 4,414 Butanedioic acid, methyl- 21,96
3 5,805 Vanillin 4,39 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4 7,754 Benzoic acid, 4-hydroxy-3-methoxy- 3,30 5 8,166 Ethanone, 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- 0,72 6 9,510 Benzaldehyde, 4-hydroxy-3,5-dimethoxy- 4,05 7 11,259 2-Propenal, 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- 1,12 8 19,306 n-Hexadecanoic acid 0,41 9 26,461 9,12-Octadecadienoic acid, ethyl ester 0,22 10 38,192 (+)-.alpha.-Tocopherol acetate 1,20
Nhận xét: Kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate quả dứa dại cho thấy: Trong dịch chiết ethyl acetate có 10 cấu tử được phát hiện, trong đó chủ yếu là butanedioic acid, methyl- (21,96%) và các cấu tử
còn lại chiếm tỷ lệ rất thấp. Trong đó có một số cấu tử có hoạt tính sinh học như: vanillin (chống oxy hóa, chống co giật), ethanone,1-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)- (chống viêm không steroid, giảm đau, hạ sốt, điều trị viêm
khớp, chống oxy hóa và ức chế enzyme), n-hexadecanoic acid (ức chế
enzyme), (+)-alpha-tocopherol acetate (chống oxy hóa).
3.3.3. Thành phần hóa học dịch chiết dichloromethane
Dịch chiết dichloromethane của quả dứa dại được phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ, kết quả phân tích được thể hiện trên sắc ký đồ
(xem Hình 3.3).
Bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), so sánh với thư viện phổ NIST đã định danh được một số cấu tử trong dịch chiết dichloromethane,
được nêu trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Một số cấu tử trong dịch chiết dichloromethane
STT Thời gian lưu, phút Tên hợp chất % Diện tích píc 1 5,672 Tetradecane 0,24 2 5,822 Vanillin 0,15 3 6,736 Pentadecane 0,57 4 6,949 Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl) 0,11 5 7,034 Butylated Hydroxytoluene 0,14 6 8,192 Hexadecane 0,48 7 9,835 4-(4-Chlorophenyl)pyridine 0,33 8 10,211 Heptadecane 0,25 9 26,850 2-Propen-1-one, 1-(4-aminophenyl)-3-phenyl- 0,30 10 32,435 13-Docosenamide, (Z)- 0,93 Nhận xét: Kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết dichloromethane quả dứa dại cho thấy: Trong dịch chiết dichloromethane có 10 cấu tử được phát hiện, tất cả các cấu tử đều chiếm tỷ lệ rất thấp
(0,11% - 0,93%). Trong đó có một số cấu tử có hoạt tính sinh học như: vanillin (chống oxy hóa, chống co giật) và butylated hydroxytoluene (chống oxy hóa).
Kết quả định danh bằng GC-MS cho thấy trong 3 dịch chiết: Dịch chiết n-hexane được 22 cấu tử , dịch chiết ethyl acetate được 10 cấu tử và dịch chiết dichloromethane 10 cấu tử. Tổng % diện tích píc các cấu tử được định danh trong dịch chiết n-hexane là lớn nhất (83,11%), dịch chiết ethyl acetate (39,23%) và dịch chiết dichloromethane là nhỏ nhất (3,50%).
Điều này chứng tỏ n-hexane có khả năng hòa tan rất tốt và chiết được hàm lượng rất lớn các cấu tử, còn dichloromethane hòa tan kém và chiết được hàm lượng rất nhỏ các cấu tử có trong quả dứa dại.
Đối với các cấu tử có trong ba dịch chiết khác nhau thì trong dịch chiết n-hexane của quả dứa dại có hàm lượng phát hiện hầu như nhiều hơn so với dịch chiết ethyl acetate và dịch chiết dichloromethane.
3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC CAO CHIẾT QUẢ DỨA DẠI 3.4.1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh 3.4.1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh
Các cao chiết H và cao chiết EA được thử hoạt tính kháng sinh tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả được nêu trong Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các cao chiết quả dứa dại Nồng độ ức chế > 50% sự phát triển của vi sinh vật và nấm kiểm định – IC50 (μg/ml) Vi sinh vật và nấm kiểm định
Cao chiết H Cao chiết EA
Staphylococcus Aureus > 128 > 128 Bacillus subtilis > 128 > 128 Gram (+) Lactobacillus fermentum > 128 > 128 Salmonella enterica > 128 > 128 Escherichia Coli > 128 > 128 Gram (-) Pseudomonas aeruginosa > 128 > 128 Nấm Candida albicans > 128 > 128
Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.8 hoạt tính kháng sinh của các cao chiết quả dứa dại cho thấy: Cao chiết H và cao chiết EA đều không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật trên ở nồng độ <128 μg/ml.
3.4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư gan (Hep-G2) (Hep-G2)
Các cao chiết được thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt nam. Kết quả được nêu trong Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) của các cao chiết quả dứa dại
Hoạt tính gây độc tế bào trên dòng Hep-G2 (μg/ml) % ức chế tại nồng độ STT Tên mẫu 128 32 8 2 0,5 Giá trị IC50 1 Cao chiết H 37 30 29 23 20 >128 2 Cao chiết EA 77 33 30 15 11 69,09 Ellipticin 0,31
Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.9 hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) của cao chiết quả dứa dại cho thấy: Cao chiết n- hexane không có khả năng ức chế dòng tế bào này tại giá trị IC50 ở nồng
độ nhỏ hơn 128 μg/ml và cao chiết ethyl acetate ức chế dòng tế bào này tại giá trị IC50 ở nồng độ 69,09μg/ml.
3.5. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 3.5.1. Hợp chất QDDH2.5
Hợp chất QDDH2.5 được phân lập dưới dạng chất dầu màu vàng nhạt (xem hình 3.4). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.4. Hợp chất QDDH2.5 Phổ 1H- MNR của hợp chất QDDH2.5 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của nhóm CH3 đầu mạch (dH 0,88 t, J = 7,0 Hz), nhóm CH2 (dH 1,24-1,36), nhóm –CH=CH– (dH 5,35 m), nhóm CH2–O–CO (dH 4,13) và nhóm –CH2–COO (dH 2,28) (xem Hình 3.5). Hình 3.5. Phổ1H-NMR của hợp chất QDDH2.5
Hình 3.6. Phổ13C-NMR của hợp chất QDDH2.5
Trên phổ 13C-NMR và DEPT của QDDH2.5 (xem Hình 3.6, 3.7) xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của nhóm CH3 đầu mạch (dC 14,23), nhóm C=C (dC 130,02), nhóm C=O (dC 173,99). Tín hiệu nhóm C–O (dC 60,17) cho phép xác định vị trí ester hóa của nó với nhóm C=O [12]. Từ các dữ kiện thu được, cho phép xác định hợp chất QDDH2.5 là este của acid béo mạch dài không bão hòa.
3.5.2. Hợp chất QDDH3.1
Hợp chất QDDH3.1được phân lập dưới dạng dầu màu vàng nhạt (xem hình 3.8). Hình 3.8. Hợp chất QDDH3.1 Các phổ NMR (xem Hình 3.9, 3.10) của hợp chất QDDH3.1 đặc trưng cho một hợp chất glycerol trialkanoate với sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của gốc glycerol tại dC 62,13 (C-1 và C-3)/dH 4,30 (2H, dd, J = 4,5 12,0 Hz, H-1) và 4,13 (2H, dd, J = 5,5, 12,0 Hz, H-3) và dC 68,94 (C-2)/dH 5,25 (1H, m, H-2); cùng với ba nhóm C=O dC 173,26 (C-1’), 172,85 (C-2’) và 173,29 (C-3’). Sự xuất hiện tín hiệu nhóm CH3 ở cuối mạch tại dH 0,88 với cường
độ tích phân bằng 9 cũng khẳng định sự có mặt của ba nhánh axit béo. Ngoài ra, sự xuất hiện liên kết đôi cũng được xác định bằng các tín hiệu cacbon cộng hưởng trong vùng dC 127,93 - 130,23. Từ các dữ kiện thu
được, cho phép xác định hợp chất QDDH3.1 là este của glycerol với acid béo mạch dài không bão hòa.
Hai hợp chất QDDH2.5 và QDDH3.1 có cấu trúc phức tạp. Để xác định vị trí nối đôi và độ dài mạch cần nhiều thời gian và phân tích một số phổ hai chiều, đặc biệt là tiến hành một số phản ứng chuyển hóa hóa học.
Hình 3.9. Phổ1H-NMR của hợp chất QDDH3.1