Quả dứa dại được tách và loại bỏ những quả hạch sâu bệnh, rửa sạch, chẻ nhỏ, phơi khô, xay thành bột có cỡ bột nửa thô (không ít hơn 95% qua rây số 710 và không quá 40% qua rây số 250) bằng máy xay (xem Hình 2.2).
Hình 2.2. Quả dứa dại đã chế biến và bột quả dứa dại 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
- Các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC được ghi trên Máy cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao 500MHz, BRUKER AVANCE 500.
- Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Agilent 7890A/5975C. Cột sắc ký HP5MS (dài 30 m; đường kính trong 0,25 mm; lớp phim dày 0,25 μm).
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Aanalyst 800 hãng Perkin Elmer.
- Cột sắc ký thủy tinh 20 mm x 600 mm . Hạt nhồi là silica gel G cỡ hạt 63-200 μm Merck .
- Sắc ký bản mỏng: Silica gel 60 F254 Merck.
- Buồng soi UV Vilber Lourmat bước sóng 254 nm và 365 nm. - Máy xay Panasonic MX-119N.
- Cân phân tích satorius CP224S.
- Tủ sấy Memmert VM 400 khoảng nhiệt độ 30-280oC.
- Lò nung Nabertherm L3/6C khoảng nhiệt độ nung 30-1100oC.
- Các dụng cụ thủy tinh: Bình thủy tinh, phễu chiết, ống đong, cốc thủy tinh ...
2.2.2. Hóa chất
Một số hóa chất thuốc thử sử dụng chính được nêu trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Hóa chất thuốc thử
STT Tên hóa chất Nước sản xuất 1 n-Hexane Trung Quốc
2 Ethyl acetate Trung Quốc 3 Dichloromethane Trung Quốc
4 Ethanol Trung Quốc
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Nội dung thực nghiệm quá trình chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của quả dứa dại được trình bày theo sơ đồ (xem Hình 2.3).
Hình 2.3. Sơđồ nghiên cứu Xác định độẩm, tro toàn phần và hàm lượng kim loại nặng Quả dứa dại (tươi) Dịch nước Định danh các cấu tử trong các dịch chiết H, EA, DCM Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập Thử hoạt tính sinh học các cao chiết H, EA Hòa tan với nước. Chiết lần lượt với
n-hexane, ethyl acetate và dichloromethane Mẫu nguyên liệu
(khô)
Cao ethanol thô
Các dịch chiết H, EA, DCM
Các cao chiết H, EA, DCM
Các hợp chất được phân lập và tinh chế từ cao chiết H
Chiết với ethanol
Lọc, cô quay thu hồi dung môi
Đo phổ1H-MNR, 13C-NMR… Sắc ký cột
Sắc ký lớp mỏng
Lọc, cô quay thu hồi dung môi Xử lý mẫu
GC-MS
2.4. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 2.4.1. Xác định độẩm
Cân khoảng 2 g bột quả dứa dại khô vào dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài đã được sấy khô và biết khối lượng chính xác. Sấy 3 giờ ở 105oC trong tủ sấy (xem Hình 2.4), lấy ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân, tính khối lượng. Sau
đó, sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy và tiến hành quá trình như trên cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp không quá 0,5 mg thì dừng quá trình sấy.
Hình 2.4. Tủ sấy
Dựa vào các kết quả thu được, khối lượng quả dứa dại trước và sau khi sấy. Từ đó, ta tính được độ ẩm theo công thức sau:
100 . 0 1 0 m m m - = w Trong đó: - w: Độẩm (%)
- m0: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) - m1: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)
2.4.2. Xác định tro toàn phần
Cân khoảng 2 g bột quả dứa dại khô cho vào cốc sứ đã nung và biết chính xác khối lượng. Đặt cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở 450oC cho tới khi không còn carbon (tro có dạng bột mịn, màu trắng) (xem Hình 2.5). Lấy cốc sứ ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm đến khi cốc nguội hẳn,
đem cân và tính khối lượng. Sau đó, nung thêm 1 giờ trong lò nung và tiến hành quá trình như trên cho đến khi khối lượng không đổi.
Hình 2.5. Lò nung
Tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo mẫu nguyên liệu đã làm khô trong không khí được tính theo công thức sau:
H = mm1
0 . 100 Trong đó:
- H: Tỷ lệ phần trăm tro toàn phần (%) - m0: Khối lượng mẫu trước khi tro hoá (g) - m1: Khối lượng tro (g)
2.4.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng
Dụng cụ, thiết bị
Bình phá mẫu bằng polytetrafluoroethylen thể tích 120 ml có nắp đậy kín, có van điều chỉnh áp suất bên trong và một ống bằng polytetrafluoroethylen để xả khí.
Lò vi sóng với tần số 2450 MHz có công suất điều chỉnh được từ 0 đến (630 ± 70 W), vách lò phủ một lớp polytetrafluoroethylen. Lò có quạt hút thay đổi được tốc độ, có hệ thống đĩa quay và ống hút để xả khói.
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Aanalyst 800 hãng perkin Elmer dùng đèn cathod rỗng là nguồn phát xạ và đèn deuterium hiệu chỉnh đường nền (xem Hình 2.6). Phần mềm điều khiển hệ thống Winlab 32 for AA, máy
được nối với:
- Bộ hóa hơi nguyên tử không ngọn lửa lò graphit đối với cadimi,
đồng, chì, sắt, nickel và kẽm.
- Bộ hoá hơi hydrid đối với arsen và bộ phận hóa hơi lạnh cho thuỷ
ngân, hoặc một bộ hoá hơi khác có tính năng phù hợp cho 2 nguyên tố này.
Tiến hành
Rửa sạch các đồ đựng bằng thủy tinh và dụng cụ thí nghiệm bằng dung dịch acid nitric10 g/l trước khi dùng.
Dung dịch thử: Cân và chuyển vào bình phá mẫu một lượng khoảng 0,5 g bột quả dứa dại. Thêm 6 ml acid nitric không có kim loại nặng và 4 ml acid hydrocloric không có kim loại nặng. Đậy kín bình.
Đặt bình phá mẫu vào lò vi sóng. Tiến hành phá mẫu: 80% công suất ở 15 phút đầu, 100% công suất ở 5 phút tiếp theo và 80% ở 20 phút cuối.
Để nguội các bình ngoài không khí, thêm vào mỗi bình 4 ml acid sulfuric không có kim loại nặng. Lặp lại các bước phá mẫu như trên một lần nữa. Sau khi để nguội, mở bình phá mẫu ra, thu được dung dịch. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50 ml, tráng bình phá mẫu 2 lần, mỗi lần với 15 ml nước và tập trung dịch tráng vào bình định mức. Thêm 1,0 ml dung dịch magnesi nitrat 1% và 1,0 ml dung dịch amoni dihydrophosphat 10%, thêm nước vừa đủ 50 ml.
Dung dịch mẫu trắng: Trộn 6 ml acid nitric không có kim loại nặng và 4 ml acid hydrocloric không có kim loại nặng vào bình phá mẫu và tiến hành phá mẫu như đối với dung dịch thử.
a. Định lượng cadimi, đồng, chì và kẽm
Xác định hàm lượng cadimi, đồng, chì và kẽm bằng phương pháp thêm chuẩn, dùng các dung dịch đối chiếu của mỗi kim loại nặng và áp dụng các thông số kỹ thuật được nêu trong Bảng 2.2. Độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng được tự động trừ vào độ hấp thụ của dung dịch thử.
Bảng 2.2. Các thông số kỹ thuật để tiến hành phép thử xác định hàm lượng cadimi, đồng, chì và kẽm Đơn vị Cd Cu Pb Zn Bước sóng nm 228,8 324,8 283,5 213,9 Độ rộng khe nm 0,5 0,5 05 0,5 Cường độđèn mA 6 7 5 7 Nhiệt độ tro hoá oC 800 800 800 800 Nhiệt độ nguyên tử hoá oC 1800 2300 2200 2000 Hiệu chỉnh đường nền có không không Không Tốc độ khí nitrogen lít/phút 3 3 3 3
b. Định lượng arsen và thủy ngân
Xác định hàm lượng arsen và thủy ngân trong mẫu dựa vào các dung dịch chuẩn arsen hoặc thủy ngân đã biết nồng độ bằng phương pháp xác định trực tiếp với hệ thống hoá hơi hydrid đối với arsen và hóa hơi lạnh đối với thủy ngân, hoặc với một thiết bị hoá hơi khác phù hợp.
Arsen: Áp dụng các thông số kỹ thuật được nêu trong Bảng 2.3.
Dung dịch mẫu: Lấy 19,0 ml dung dịch thử hoặc trắng chuẩn bị như
trên, thêm 1 ml dung dịch kali iodid 20%. Để yên dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 50 phút hoặc ở 70 oC trong 4 phút.
Acid: Acid hydrocloric không có kim loại nặng.
Dung dịch khử:Dung dịch natri borohydrid 0,6% trong dung dịch natri hydroxyd 0,5%.
Thủy ngân: Áp dụng các thông số kỹ thuật được nêu trong Bảng 2.3. Dung dịch mẫu: Dung dịch thử hoặc dung dịch trắng chuẩn bị như
Acid: Dung dịch acid hydrocloric không có kim loại nặng.
Dung dịch khử: Dung dịch thiếc (II) clorid 1% trong dung dịch acid hydrocloric loãng không có kim loại nặng.
Bảng 2.3. Các thông số kỹ thuật để tiến hành phép thử
xác định hàm lượng arsen và thủy ngân
Đơn vị As Hg Bước sóng nm 193,7 253,7 Độ rộng khe nm 0,2 0,5 Cường độđèn mA 10 4 Tốc độ acid ml/phút 1,0 1,0 Tốc độ dung dịch khử ml/phút 1,0 1,0 Tốc độ dung dịch mẫu ml/phút 7,0 7,0 Buồng đo Thạch anh (làm nóng) Thạch anh (không làm Hiệu chỉnh đường nền không không Tốc độ khí nitrogen lít/phút 0,1 0,1
2.5. TRÍCH LY CÁC LOẠI CAO
Mẫu bột quả dứa dại khô (1,8 kg) được ngâm chiết trong 6 lít dung môi ethanol 95% ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ tiến hành lọc, thu được dịch chiết ethanol đầu tiên. Tiến hành lặp lại quá trình ngâm mẫu trong ethanol 95% thêm 4 lần nữa. Cuối cùng lọc bỏ bã thực vật thu được dịch chiết ethanol. Dịch chiết sau 5 lần ngâm chiết được gộp lại lọc và cô quay thu hồi dung môi
Hình 2.7. Sơđồ trích ly các loại cao
Cao chiết H
Mẫu nguyên liệu khô (1,8 kg)
Cao ethanol thô
Dịch nước
Cao chiết EA Dịch nước
Cao chiết DCM Dịch nước - Chiết với ethanol 95%
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi
- Hòa tan với nước cất - Chiết với n-hexane
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi
- Chiết với dichloromethane - Lọc, cô quay thu hồi dung môi - Chiết với ethyl acetate
Hòa loãng phần chiết ethanol trong nước cất và lần lượt chiết với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và dichloromethane. Các dịch chiết
được làm khan nước bằng Na2SO4 khan ta thu được các dịch chiết ký hiệu là dịch chiết H, dịch chiết EA và dịch chiết DCM. Cô quay thu hồi dung môi, thu được các phần chiết tương ứng ký hiệu là cao chiết H, cao chiết EA và cao chiết DCM theo sơ đồ trích ly các loại cao (xem Hình 2.7).
2.6. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC DỊCH CHIẾT
Thành phần hoá học các dịch chiết H, dịch chiết EA và dịch chiết DCM quả dứa dại được xác định bằng hệ thống sắc ký khí khối phổ GC- MS 7890A/5975C, Agilent technology, Mỹ. Cột tách mao quản HP - 5MS (5% Phenyl Methyl Silox): 30 m x 250 μm x 0,25 μm (xem Hình 2.8).
Hình 2.8. Hệ thống sắc ký khí khối phổ
Định danh thành phần hóa học các dịch chiết quả dứa dại được xác
định bằng cách so sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã
2.7. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Các cao chiết H và cao chiết EA được thử hoạt tính kháng sinh và hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
Thử hoạt tính kháng sinh dùng các chủng vi sinh vật và nấm được thử
là các loại sau:
- Gram (+): Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
Lactobacillus fermentum - Gram (-): Salmonella enterica
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa - Nấm: Candida albicans
Thử hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) dùng ellipticin làm chất đối chiếu.