Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết.
Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là: - Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
- Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi.
- Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
Dược liệu có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết. Kích thước của bột dược liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả
của quá trình chiết.
Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau: Chiết ở nhiệt độ
thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường), nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng) hay chiết với thiết bị như soxhlet… tùy yêu cầu,
điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp.
Trong phương pháp ngâm, dược liệu được ngâm trong một lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu.
Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là một quá trình chiết ngược dòng với nồng độ
dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Tùy từng loại hoạt chất mà chọn dung môi chiết cho thích hợp. Về
nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, ethanol thường hay dùng vì đây là dung môi thông dụng, có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong ethanol sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết xuất cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết xuất mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả chiết xuất.
1.4.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng đểđịnh tính, thử
tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha
tĩnh là chất hấp phụđược chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu
được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế
hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
b a Rf =
Trong đó:
a: Khoảng cách di chuyển của chất phân tích.
b: Khoảng cách di chuyển của dung môi tính từđiểm chấm mẫu. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi, vị
trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tương đối Rr. Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu được sắc ký trong cùng điều kiện và trong cùng bản mỏng với mẫu thử:
c a Rr =
Trong đó:
a: Khoảng cách di chuyển của chất phân tích.
c: Khoảng cách di chuyển của chất chuẩn đối chiếu. Giá trị Rr có thể lớn hơn hay nhỏ hơn 1.
Cách tiến hành:
Dụng cụ:
- Bình triển khai sắc ký, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín.
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.
- Dụng cụđể phun thuốc thử.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
- Tủ hút hơi độc.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Một máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l µl, 2 µl, 5 µl, 10 µl đến 20 µl, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.
Trường hợp phòng thí nghiệm không có điều kiện trang bị các loại bản mỏng tráng sẵn thì tự chuẩn bị lấy bản mỏng với các dụng cụ sau đây:
- Các tấm kính phẳng có kích thước phù hợp đã được xử lý trước bằng hóa chất rồi rửa sạch bằng nước và sấy khô.
- Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp.
- Giá để xếp các tấm kính đã trải.
Chuẩn bị bản mỏng:
- Các phiến kính phải được lau chùi cẩn thận và tẩy sạch hoàn toàn các chất béo bằng cách ngâm trong dung dịch sulfocromic. Sau đó, cọ kỹ bằng bàn chải dưới tia nước máy rồi tráng nước cất và sấy khô trên giá ở nhiệt độ
thường hay trong tủ sấy.
- Ðiều chế vữa của chất hấp phụ: Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silica gel G, cellulose, nhôm oxyd, trong số đó silica gel G được dùng thông dụng nhất. Trộn 25 g silica gel G với 50 ml nước cất và nhào trong cối hoặc lắc mạnh trong bình nón có dung tích 200-250 ml, nút kín, trong 30-45 giây. Dịch treo tạo được ở dạng lỏng và
đồng nhất, se lại trong vài phút sau đó, vì có bột bó. Rót ngay vào thiết bị trải
đã điều chỉnh độ dày cho bản mỏng khoảng 0,25 mm (nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng).
- Ðể nguyên các phiến kính tại chỗ khoảng 10 phút tới khi mặt trên hết bóng, hoặc để khô tự nhiên qua đêm tại nhiệt độ phòng.
- Hoạt hóa: Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105- 110oC trong 30 phút. Ðể nguội rồi bảo quản trong bình hút ẩm. Khi dùng, nếu cần thì hoạt hóa lại bằng cách sấy ở 105-1100C trong 1 giờ rồi cạo bỏ một dải mỏng chất hấp phụ dọc hai bên cạnh của tấm kính.
Chuẩn bị bình khai triển:
Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20-25oC. Muốn thu được những kết quả
lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ biến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử
dụng những hệ pha động phức tạp phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị số Rf.
Chấm chất phân tích lên bản mỏng:
Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp. Lượng chất nhỏ quá có thể
không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường
độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 µg). Lượng mẫu thông thường cần
đưa lên bản mỏng là 0,1 µg đến 50 µg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ
0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l ml đến 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế. Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10-50 mg. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất
loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5-2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8-1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2-6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mao quản thường.
Triển khai sắc ký:
Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt
độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ
dẫn trong chuyên luận riêng.
Đánh giá: Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng.
1.4.6. Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở hai đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp. Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổđiển dùng trong điều chế các chất và sắc ký cột hiện đại thường dùng trong phân tích
như sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí... ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển. Với kích thước cột lớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách và phân lập các chất.
Trong sắc ký cột cổ điển, người ta thường dùng các cột thủy tinh
đường kính 1-5 cm dài 30-100 cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ 15-300 µm. Kích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ
dàng nhưng hiệu năng tách kém. Với vật liệu nhồi cột là silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15-40 µm), loại vừa (40-63 µm) và loại thô (63-200 µm). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả năng tách của hệ thống. Tỉ lệ
mẫu/pha tĩnh thường là 1/30-1/100 hay hơn. Trong 1 vài kỹ thuật, tỉ lệ này có thể tăng tới 1/10.
Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp. Dung môi có các chất
được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ phận hứng phân đoạn. Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để
thu được chất tinh khiết. Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất.
Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thủy tĩnh. Với cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng đến kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán. Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn. Để khắc phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sắc ký cột cải tiến đã
được sử dụng giúp giảm thời gian phân tách. Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm. Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản
sắc ký cột nhanh và sắc ký cột chân không. Cả hai đều sử dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu. Sắc ký cột nhanh sử dụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn sắc ký cột chân không sử dụng áp suất âm ở cuối cột.
Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu và đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu.
1.4.7. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
a. Sắc ký khí
Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu.
Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ
thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.
Cột sử dụng trong sắc ký khí được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép