L ỜI CẢM ƠN
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
Quá trình thực nghiệm được mô tả theo hình 2.2. Khối lượng soapstock và thể
tích EtOAc cũng như các dung môi khác được trình bày theo từng mục dưới đây tương ứng theo từng giai đoạn.
Hình 2.2. Sơđồ thực nghiệm 1) EtOAc
Tính toán lượng ST (g)/V(ml) EtOAc Soapstock Xác định hàm lượng rắn-khô
105oC, 4 giờ Hỗn hợp đồng nhất 2) siêu âm 20 phút t0 phòng 1) 100 μl hh + 900 μl C2H5OH 2) Lọc HPLC Xác định hiệu suất phản ứng thủy phân Phổ hấp phụ λ=320-325 nm Xác định hàm lượng γ-oryzanol và FA Chếđộ gradient (MeOH/ACN=1:1) và dd H3PO4 loãng KOH/γ-oryzanol (wt/wt) =20:1 hh ph/ứng 100 μl CH3COOH đặc; 300 μl C2H5OH 100 μl dd pứ HPLC 75oC; 3 giờ Tinh chế FA Xác định hàm lượng và độ tinh khiết FA bằng HPLC Khảo sát hệ dung môi, kiểm tra độ sạch của FA bằng SKBM Loại tạp chất → FA thô
2.2.2. Xác định hàm lượng rắn – khô trong mẫu soapstock
Cân 2 mẫu soapstock (mỗi mẫu cân lặp lại 2 lần) với khối lượng được trình bày ở bảng 2.1, đặt các mẫu này vào tủ sấy ở 105oC và sấy trong 4 giờ. Sau khi sấy xong, cân lại khối lượng các mẫu để tính hàm lượng rắn – khô.
Bảng 2.1. Khối lượng từng mẫu soapstock trước khi sấy
Tên mẫu Mẫu mo (g) mo+cốc (g)
ST03 3.00 43.22
ST03 3.00 43.22
ST04 3.00 44.34
ST04 3.00 44.19
2.2.3.Chiết γ-oryzanol từ soapstock
a. Lựa chọn dung môi chiết γ-oryzanol từ soapstock
Dung môi thích hợp dùng để chiếtγ-oryzanol phải là dung môi hòa tan tốt γ- oryzanol. Nhằm chọn được dung môi phù hợp, trước hết thửđộ tan của γ-oryzanol trong một loạt các dung môi được kiểm chứng như sau:
– Hòa tan 2.4 gam γ-oryzanol trong 25 ml dung môi: MeOH, EtOH, EtOAc,
điethyl ete (C2H5)2O, aceton, ACN, tetra hidrofuran (THF), H2O. Sau khi kiểm tra
độ tan của γ-oryzanol trong các dung môi trên, căn cứ vào nhiệt độ sôi và độ tan để
chọn dung môi phù hợp.
– Dung môi được lựa chọn là EtOAc.
b. Chiết γ-oryzanol từ soapstock
Mẫu soapstock thường được chiết theo hai cách.
@ Cách thứ nhất: Chiết mẫu ướt với dung môi là EtOAc (sử dụng bồn rửa siêu âm Elma 38 kHz, ở nhiệt độ thường).
Lấy 10 gam soapstock cho vào các bình Erlenmeyer 250 ml, sau đó thêm 100 ml dung môi EtOAc. Đặt bình này vào trong bể siêu âm Elma (38 kHz) và siêu âm trong 20 phút, thu được các hỗn hợp tương đối đồng nhất. Lọc và thu lấy các dịch chiết EtOAc (sau khi siêu âm, dịch chiết thu được còn 80 ml).
Hàm lượng axit ferulic và γ-oryzanol trong mẫu soapstock được tính: (mg) mST * 1000 * (mL) V * (mg/L) C (%) F m =
Trong đó, C: nồng độ axit ferulic hoặc γ-oryzanol tính theo ppm (mg/l) V: thể tích dịch chiết (80 ml)
F: độ pha loãng (F = 10)
mST: khối lượng soapstock ban đầu dùng để chiết (10,000 mg).
@ Cách thứ hai: Mẫu soapstock được sấy khô ở 105ºC cho tới khi khối lượng không đổi. Mẫu khô được chiết như sau:
Cho 30 ml dung dịch EtOAc vào 1.4 g soapstock khô (thu được từ 3 gam soapstock ướt) trong bình Erlenmeyer 250 ml, đặt siêu âm trong bể Elma 38 kHz, trong thời gian 20 phút. Lọc thu lấy dịch chiết và định mức tới vạch trong bình định mức 50 ml bằng EtOAc. Một lượng nhỏ mẫu được đem đi phân tích bằng máy sắc ký lỏng cao áp HPLC.
Trong đề tài này chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu theo cả hai cách, và lựa chọn một trong hai cách để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Để điều chế FA, chúng tôi thực hiện phản ứng với khối lượng soapstock lớn (khoảng 96 gam cho một lần điều chế), như hình 2.3. Phần dịch chiết được cất quay dưới áp suất thấp để đuổi bớt dung môi. Phần dung môi thu được khi cô quay ở lần chiết trước được tận dụng để chiết tiếp lần sau. Phần dịch chiết thu được sau cô quay có thể tích là 60 ml, trong đó nồng độ γ-oryzanol đạt gần đúng là 48 mg/ml. Dịch chiết này (gọi là dịch chiết GO) sẽ được thủy phân trong điều kiện thích hợp
Hình 2.3. Sơđồ chiết γ-oryzanol từ soapstock
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/soapstock (V/m) đến hiệu suất của quá trình chiết γ-oryzanol
Lấy 10 gam soapstock cho vào các bình Erlenmeyer 250 ml có nắp vặn khác nhau. Dung môi EtOAc với các thể tích khác nhau 10, 20, 50, 100 ml được rót vào các cốc có dãn nhán tương ứng với các tỉ lệ dung môi/rắn (V/m) là 1, 2, 5, 10. Đặt các bình này vào trong bể siêu âm Elma (38 kHz) và siêu âm trong 20 phút, thu
được các hỗn hợp tương đối đồng nhất. Lọc và thu lấy các dịch chiết EtOAc, đưa lần lượt vào các bình định mức 100 ml có nhãn tương ứng, định mức bằng EtOAc tới vạch.
d. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất của quá trình chiết γ-oryzanol
Lấy 10 gam soapstock và 50 ml EtOAc cho vào các bình Erlenmeyer 250 ml có nắp vặn khác nhau, dán nhãn. Đặt lần lượt các bình này vào trong bể siêu âm Elma (38 kHz) với thời gian siêu âm lần lượt là 10, 15, 20, 30 phút, thu được các
96 gam soapstock Dung dịch A Dịch chiết GO (EtOAc) 60 ml dịch chiết GO 1) 120 ml EtOAc 2) siêu âm 20 phút Lọc
Cô quay chân không
Phân tích hàm lượng γ-oryzanol
hỗn hợp tương ứng. Lọc và thu lấy các dịch chiết EtOAc, đưa lần lượt vào các bình
định mức 100 ml có nhãn tương ứng, định mức bằng EtOAc tới vạch.
2.2.4. Xác định hàm lượng γ-oryzanol và FA có trong mẫu soapstock
– Phân tích γ-oryzanol và FA bằng HPLC pha đảo sử dụng cột Inertsil ODS-3 C18 (4.6 mm x 250 mm, 5 μm).
– Phương pháp phân tích sử dụng chế độ gradient với hai pha động là dung dịch axit H3PO4 0.283% (pha A) có pH nằm trong khoảng 3 – 4, và pha B là hỗn hợp MeOH : ACN (1:1). Chếđộ gradient như sau:
– Giữ cho tỉ lệ pha B/A là 30:70 tại thời điểm 0 phút, và gradient tới 100:0 trong thời gian là 15 phút; giữ tiếp trong 25 phút, rồi tiếp tục gradient về tỉ lệ 70:30 trong 5 phút, 30:70 trong 5 phút và giữ trong 5 phút. Tốc độ dòng là 0.8 ml/phút.
Ø Phương pháp lập đường chuẩn
• Đường chuẩn γ-oryzanol
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan 100 mg γ-oryzanol trong 15 ml dung dịch EtOAc, chuyển vào bình định mức 20 ml, và định mức tới vạch, ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 5 mg/ml tương đương 5,000 ppm.
Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy dung dịch chuẩn gốc với thể tích thích hợp (ml) chuyển vào các bình định mức 100 ml, và lần lượt định mức tới vạch bằng EtOAc, theo như bảng 2.2.
Bảng 2.2. Cách lập đường chuẩn γ-oryzanol
Vchuẩn gốc (ml) 2 5 10 20
Số lần pha loãng so với dung
dịch gốc (lần) 50 20 10 5
V bình định mức (L) 0.1 0.1 0.1 0.1
• Đường chuẩn axit trans-ferulic
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan 25 mg axit trans-ferulic trong 20 ml dung
dịch EtOH, chuyển vào bình định mức 25 ml, và định mức tới vạch, ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml tương đương 1,000 ppm.
Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy dung dịch chuẩn gốc với thể tích thích hợp (ml) chuyển vào các bình định mức 100 ml, và lần lượt định mức tới vạch bằng EtOAc (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Cách lập đường chuẩn axit trans-ferulic
Vchuẩn gốc (ml) 2 5 10 20 25
V bình định mức (L) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Số lần pha loãng so với dung
dịch gốc (lần) 50 20 10 5 4
Nồng độ làm việc (mg/L) 20 50 100 200 250
• Đường chuẩn ethyl ferulate
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan 25 mg ethyl ferulate trong 20 ml dung dịch EtOH, chuyển vào bình định mức 25 ml, và định mức tới vạch, ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml tương đương 1,000 ppm.
Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy dung dịch chuẩn gốc với thể tích thích hợp (ml) chuyển vào các bình định mức 100 ml, và lần lượt định mức tới vạch bằng EtOAc (bảng 2.4).
Bảng 2.4. Cách lập đường chuẩn ethyl ferulate
Vchuẩn gốc (ml) 1 2.5 5
V bình định mức (L) 0.1 0.1 0.1
Số lần pha loãng so với dung dịch gốc
(lần) 100 40 20
Phổ hấp phụ của FA và γ-oryzanol được quan sát ở vùng bước sóng 320-325 nm (bước sóng hấp phụ cực đại sẽđược xác định chính xác sau khi đo phổ hấp phụ
của FA và γ-oryzanol). Hàm lượng γ-oryzanol, FA, ethyl ferulate trong mẫu phản
ứng được tính toán dựa trên đường chuẩn được thiết lập ở cùng điều kiện.
Với điều kiện này, trong sắc ký đồ, FA bị rửa giải trước cùng các hợp chất phenolic khác, sau đó mới đến các pic của γ-oryzanol (hỗn hợp các ferulate) được tách ra nhanh hơn khi tăng dần hàm lượng pha B trong hỗn hợp pha động. Do trong soapstock có rất nhiều các hợp chất khác nhau, nên cần phải tăng hàm lượng pha B lên đến 100% để rửa giải hết các chất ra khỏi cột, thời gian chạy mẫu cần đến 55 phút, tránh trường hợp các chất còn lại trong cột sẽ ảnh hưởng đến việc phân tích các mẫu tiếp theo.
2.2.5. Phản ứng thủy phân dịch chiết γ-oryzanol và thu nhận axit ferulic
a. Phản ứng thủy phân dịch chiết γ-oryzanol
Nhóm nghiên cứu trước tại Trung tâm Công nghệ Môi trường Đà Nẵng đã khảo sát được các điều kiện của phản ứng thủy phân đối với chất chuẩn γ-oryzanol (độ tinh khiết > 99%). Do vậy, chúng tôi đã kế thừa các điều kiện này như sau:
– Sử dụng EtOH làm đồng dung môi. – Tỉ lệ KOH/ γ-oryzanol 20:1 (wt/wt). – Nhiệt độ phản ứng tại 75°C.
– Thời gian phản ứng: 3 giờ.
Từ cao chiết trong dung môi EtOAc tiến hành phản ứng thủy phân như sau: Cho 300 ml EtOH và 120 ml dung dịch KOH (480 mg/ml) vào bình phản ứng có chứa 60 ml dịch chiết GO, đặt bình phản ứng vào bểđiều nhiệt, thực hiện phản ứng thủy phân ở 750C trong 3 giờ, sau phản ứng thu được dung dịch B có thể tích ≈ 480 ml.
Trong quá trình thực hiện phản ứng thủy phân, ethyl ferulat là một hợp chất trung gian hình thành qua phản ứng trans-este hóa (tranesterification),
H3CO HO O O R + H2O H3CO HO COOH +
γ-oryzanol axit ferulic
R HO (2.1) Gốc rượu của γ-oryzanol H3CO HO COOH + KOH → H3CO HO COOK + H2O (2.2) Kali ferulate H3CO HO O O R + C2H5OH → H3CO HO COOC2H5 + Ethyl ferulate R HO (2.3)
H3CO HO COOC2H5 + KOH → H3CO HO COOK + C2H5OH (2.4) H3CO HO COOK + CH3COOH → H3CO HO COOH +CH3COOK (2.5) Do vậy, để xác định hiệu suất của phản ứng thủy phân γ-oryzanol, cần xác định nồng độ của FA, ethyl ferulate tạo thành, và γ-oryzanol còn lại.
Ø Tính hiệu suất tạo thành axit ferulic của phản ứng thủy phân
Về mặt lý thuyết, phản ứng thủy phân este đơn chức γ-oryzanol tương đương với: 602.9 gam γ-oryzanol nếu thủy phân hoàn toàn sẽ sinh ra 194.18 gam axit ferulic.
Tỉ lệ khối lượng mol phân tử là: = = 3.1
Do vậy, nếu bỏ qua sự hình thành của ethyl ferulate (thực tế, sau 3 giờ phản
ứng, pic của ethyl ferulate tại 14 phút hầu như không thấy xuất hiện), thì hiệu suất thủy phân tạo ra FA từγ-oryzanol có thểđược tính toán như sau:
Hiệu suất (H%) = * 100%
b. Phản ứng thu nhận axit ferulic
Chia dung dịch B sau phản ứng làm 03 phần bằng nhau, mỗi phần có thể tích 160 ml nhằm thực hiện thí nghiệm chiết FA sau khi điều chế với độ lặp lại 03 lần.
– Từ mỗi 160 ml dung dịch màu nâu (dịch B) thu được sau phản ứng, thêm n- hex và H2O tỉ lệ (n-hex: H2O: = 1:5) với mục đích phá vỡ sự đồng nhất của hệ sau phản ứng và hình thành 02 pha:
+ Lớp dưới B : pha chứa các hợp chất phân cực, trong đó có muối của FA. – Tách hai pha bằng phễu chiết, lớp dưới B được axit hóa bằng axit H2SO4 (1:1) đến khi pH = 5 – 6. Kết tủa trắng xuất hiện bao gồm FA, muối vô cơ K2SO4 và các tạp chất khác.
Do lượng FA thu được là tương đối nhỏ so với các tạp chất nên trong các bước tiếp theo, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết kết tủa bằng EtOAc để thu được dịch chiết EtOAc có chứa FA.
2.2.6. Tách và tinh chế FA từ hỗn hợp phản ứng
– Quy trình tách và tinh chế FA được mô tả theo hình 2.4. Tương ứng với các lần chiết 1; 2; 3 và 4 ta có các dịch chiết S1, S2, S3 và S4.
– Dịch chiết tổng S (bao gồm 4 phân đoạn chiết S1, S2, S3, S4) được cô gần cạn bằng máy cất quay áp suất thấp về 1 ml. Sau đó, FA trong dịch chiết sẽ được thăm dò độ sạch bằng sắc ký lớp mỏng, tiếp theo sẽ xác định hàm lượng cũng như độ tinh khiết bằng HPLC.
Hình 2.4. Quy trình loại tạp để thu được dịch chiết EtOAc tổng (Lớp trên) Dịch chiết EtOAc (S1) Lớp dưới 100 mlEtOAc 1) siêu âm 10 phút 2) chiết (Lớp trên) Dịch chiết EtOAc (S2) Lớp dưới 100 ml EtOAc 160 ml dd B 1) 160 ml n-hexan 2) 800 ml H2O Siêu âm 10 phút Dung dịch phân lớp Lớp trên A Lớp dưới B ~ 900 ml 5 ml dd H2SO4đđ Dung dịch + tủa trắng 100 mL EtOAc 1) siêu âm 10 phút 2) chiết 1) siêu âm 10 phút 2) chiết (Lớp trên) Dịch chiết EtOAc (S3) (Lớp trên) Dịch chiết EtOAc (S4) Dịch chiết EtOAc tổng (S) Lớp dưới 100 ml EtOAc 1) siêu âm 10 phút 2) chiết
2.2.7.Thăm dò độ sạch của FA trong dịch chiết bằng sắc ký bản mỏng
Để lựa chọn dung môi chạy sắc ký bản mỏng, chúng tôi lựa chọn dung môi có tỉ lệ EtOAc cao hơn nhiều so với n-hex nhằm tăng độ phân cực của dung môi hỗn hợp, và do đó dễ dàng rửa giải FA ra khỏi hệ. Tỉ lệ n – hex và EtOAc có thể thay
đổi cho đến khi phù hợp.
Căn cứ theo phân tích như trên, chúng tôi tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng dựa trên hệ dung môi đã chọn và kiểm tra với hệ dung môi có độ phân cực kém hơn nhằm mục đích so sánh.
Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng với các bước cơ bản sau:
@ Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp (hoặc dùng chính dịch chiết thu được pha loãng hoặc cô đặc với mức độ phù hợp)
@ Chuẩn bị 2 – 3 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
@ Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc thử. Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, ví dụ n– hex : EtOAc) phù hợp.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn các hệ dung môi sau: – n-hex : EtOAc (5:5)
– n-hex : EtOAc (3:7) – n-hex : EtOAc (1:9)
2.2.8. Xác định hàm lượng và độ tinh khiết của FA thu được từ các dịch chiết bằng HPLC pha đảo chiết bằng HPLC pha đảo
– Dịch chiết các phân đoạn S1, S2, S3, S4 có các thể tích được ghi lại sau mỗi lần chiết. Lấy 1 lượng nhỏ để phân tích bằng máy sắc ký lỏng cao áp HPLC nhằm xác định hàm lượng FA chứa trong mẫu. Dựa vào phép đo, tính toán hàm lượng FA chứa trong mỗi phân đoạn từ diện tích pic, đường chuẩn lập sẵn. Gọi CF là nồng độ
(2.1) – Sau khi tính toán hàm lượng FA trong mỗi phân đoạn chiết, và tính toán
được khối lượng FA trong các dịch chiết, ta gộp các dịch chiết lại với nhau thành dịch chiết S.
– Cân bình quả nhót 250 ml có chứa dịch chiết S tổng với khối lượng mo xác
định, sau đó cô cạn dịch chiết S bằng máy cất quay áp suất thấp tới khi khô hoàn toàn. Cân lại bình quả nhót sau khi cất quay thu được khối lượng m1 .
– Khối lượng của cao chiết trong dịch chiết tổng được tính như sau:
ms = m1 - mo (2.2) – Độ tinh khiết của axit ferulic được tính toán như sau:
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN