L ỜI CẢM ƠN
2.2.4. Xác định hàm lượng γ-oryzanol và FA có trong mẫu soapstock
– Phân tích γ-oryzanol và FA bằng HPLC pha đảo sử dụng cột Inertsil ODS-3 C18 (4.6 mm x 250 mm, 5 μm).
– Phương pháp phân tích sử dụng chế độ gradient với hai pha động là dung dịch axit H3PO4 0.283% (pha A) có pH nằm trong khoảng 3 – 4, và pha B là hỗn hợp MeOH : ACN (1:1). Chếđộ gradient như sau:
– Giữ cho tỉ lệ pha B/A là 30:70 tại thời điểm 0 phút, và gradient tới 100:0 trong thời gian là 15 phút; giữ tiếp trong 25 phút, rồi tiếp tục gradient về tỉ lệ 70:30 trong 5 phút, 30:70 trong 5 phút và giữ trong 5 phút. Tốc độ dòng là 0.8 ml/phút.
Ø Phương pháp lập đường chuẩn
• Đường chuẩn γ-oryzanol
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan 100 mg γ-oryzanol trong 15 ml dung dịch EtOAc, chuyển vào bình định mức 20 ml, và định mức tới vạch, ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 5 mg/ml tương đương 5,000 ppm.
Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy dung dịch chuẩn gốc với thể tích thích hợp (ml) chuyển vào các bình định mức 100 ml, và lần lượt định mức tới vạch bằng EtOAc, theo như bảng 2.2.
Bảng 2.2. Cách lập đường chuẩn γ-oryzanol
Vchuẩn gốc (ml) 2 5 10 20
Số lần pha loãng so với dung
dịch gốc (lần) 50 20 10 5
V bình định mức (L) 0.1 0.1 0.1 0.1
• Đường chuẩn axit trans-ferulic
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan 25 mg axit trans-ferulic trong 20 ml dung
dịch EtOH, chuyển vào bình định mức 25 ml, và định mức tới vạch, ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml tương đương 1,000 ppm.
Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy dung dịch chuẩn gốc với thể tích thích hợp (ml) chuyển vào các bình định mức 100 ml, và lần lượt định mức tới vạch bằng EtOAc (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Cách lập đường chuẩn axit trans-ferulic
Vchuẩn gốc (ml) 2 5 10 20 25
V bình định mức (L) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Số lần pha loãng so với dung
dịch gốc (lần) 50 20 10 5 4
Nồng độ làm việc (mg/L) 20 50 100 200 250
• Đường chuẩn ethyl ferulate
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan 25 mg ethyl ferulate trong 20 ml dung dịch EtOH, chuyển vào bình định mức 25 ml, và định mức tới vạch, ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml tương đương 1,000 ppm.
Dung dịch chuẩn làm việc: Lấy dung dịch chuẩn gốc với thể tích thích hợp (ml) chuyển vào các bình định mức 100 ml, và lần lượt định mức tới vạch bằng EtOAc (bảng 2.4).
Bảng 2.4. Cách lập đường chuẩn ethyl ferulate
Vchuẩn gốc (ml) 1 2.5 5
V bình định mức (L) 0.1 0.1 0.1
Số lần pha loãng so với dung dịch gốc
(lần) 100 40 20
Phổ hấp phụ của FA và γ-oryzanol được quan sát ở vùng bước sóng 320-325 nm (bước sóng hấp phụ cực đại sẽđược xác định chính xác sau khi đo phổ hấp phụ
của FA và γ-oryzanol). Hàm lượng γ-oryzanol, FA, ethyl ferulate trong mẫu phản
ứng được tính toán dựa trên đường chuẩn được thiết lập ở cùng điều kiện.
Với điều kiện này, trong sắc ký đồ, FA bị rửa giải trước cùng các hợp chất phenolic khác, sau đó mới đến các pic của γ-oryzanol (hỗn hợp các ferulate) được tách ra nhanh hơn khi tăng dần hàm lượng pha B trong hỗn hợp pha động. Do trong soapstock có rất nhiều các hợp chất khác nhau, nên cần phải tăng hàm lượng pha B lên đến 100% để rửa giải hết các chất ra khỏi cột, thời gian chạy mẫu cần đến 55 phút, tránh trường hợp các chất còn lại trong cột sẽ ảnh hưởng đến việc phân tích các mẫu tiếp theo.