6. Cấu trúc của luận văn
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KĨ THUẬT
1.2.1. Các phƣơng pháp phân huỷ mẫu phân tích
Muốn phân tích một chất trong một đối tƣợng nào đó, trƣớc hết ta phải chuyển chất đó vào dung dịch, đặc biệt với đối tƣợng phân tích là chất rắn. Có 2 cách chuyển chất rắn thành dung dịch: phƣơng pháp ƣớt và phƣơng pháp khô.
Phân loại:
1. Phƣơng pháp ƣớt 2. Phƣơng pháp khô
3. Phƣơng pháp thuỷ nhiệt 4. Phƣơng pháp clo hoá
5. Phƣơng pháp vô cơ hoá các chất hữu cơ.
Để xác định các nguyên tố vô cơ trong các hợp chất hữu cơ ở thực vật, động vật, muốn chuyển các hợp chất hữu cơ vào dung dịch, trƣớc hết ta phải chuyển các chất đó thành chất vô cơ. Cách đó gọi là vô cơ hoá.
Vô cơ hoá bằng lối khô: Cách này thƣờng dùng và khá đơn giản. Ta đem nung mẫu ở khoảng 500-6000C trong chén platin hoặc thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi. Cần chú ý rằng trong quá trình nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi nhƣ các halogen, thuỷ ngân, lƣu huỳnh...Cũng có thể chỉ cần đốt cháy các chất hữu cơ trong bình kín, dƣới áp suất cao hoặc phân huỷ bằng cách nung chảy nhƣ đối với chất vô cơ, nhƣng phải thêm chất oxi hoá nhƣ: KNO3, Na2O2...
Vô cơ hoá bằng lối ƣớt: Cách này ít đƣợc dùng vì không thuận tiện, nó chỉ đƣợc dùng khi không dùng lối khô đƣợc. Có thể phân huỷ chất hữu cơ bằng H2SO4 đặc, hỗn hợp H2SO4 + HNO3, HClO4...hoặc thêm H2O2, KMnO4 để làm tăng nhanh quá trình phân huỷ.
Vô cơ hoá bằng lối khô ƣớt kết hợp: Là sự kết hợp của hai phƣơng pháp trên. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng nhiều nhất.
1.2.2. Phƣơng pháp trọng lƣợng
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lƣợng không đổi.
Cơ sở của phƣơng pháp: Nguyên liệu ẩm có thể xem nhƣ hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nƣớc tự do: m = mo + w.
Trong đó: m: khối lƣợng chung của nguyên liệu;
mo: khối lƣợng của chất khô tuyệt đối (không có ẩm); w: khối lƣợng nƣớc chứa trong nguyên liệu.
Độ ẩm tƣơng đối () của nguyên liệu ẩm là tỷ số giữa khối lƣợng nƣớc (w) trên khối lƣợng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:
100 . w m w 100 . m w o
1.2.2.2. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 600o
C trong khoảng 6 giờ.
Dùng phƣơng pháp trọng lƣợng để khảo sát xác định một số đại lƣợng nhƣ: độ ẩm, hàm lƣợng tro trong lá, vỏ quả bứa.
Hàm lƣợng tro đƣợc xác định bằng công thức: H= m m 0 1.100%
Trong đó: mo: khối lƣợng vỏ quả khô trƣớc khi tro hóa (g); m1: khối lƣợng tro (g);
H: hàm lƣợng tro trong vỏ sấy khô ( %).
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Trong các phƣơng pháp tách và làm sạch chất, phƣơng pháp sắc ký hiện nay có thể xem là hiệu lực hơn cả, nó cho phép tách đƣợc những hỗn hợp phức tạp gồm hàng chục, thậm chí hàng trăm cấu tử.
Sắc ký là quá trình tách phụ thuộc vào sự phân bố khác nhau của các cấu tử của hỗn hợp giữa pha động thể tích và pha tĩnh phim mỏng.
- Pha động thƣờng ở trạng thái lỏng, có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là hỗn hợp hợp chất hữu cơ với nƣớc. Các chất này phải thỏa mãn các điều kiện sau: hòa tan đƣợc các chất hữu cơ; trơ với pha tĩnh; có độ nhớt càng thấp càng tốt, bền theo thời gian, có độ tinh khiết cao; cân bằng động thiết lập nhanh; phù hợp với detector đem sử dụng…
- Pha tĩnh thƣờng là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên bề mặt của chất mang trơ. Nếu là hạt thì phải có kích thƣớc đồng đều, có thể dƣới dạng hình cầu hoặc mảnh. Phải đảm bảo độ xốp nhất định, trơ và bền vững với điều kiện sắc ký. Nếu là dạng lỏng phải là một màng phim mỏng bám đều lên bề mặt của chất mang trơ (chất mang trơ có thể là SiO2, Al2O3…) Trƣớc đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng áp suất thƣờng, tuy thiết bị rẻ nhƣng hiệu suất tách thấp, rất tốn dung môi để rửa giải, nên hiện nay sử dụng HPLC. Là kết quả của sự phát triển trong suốt những thập kỉ qua về những cải tiến về thiết bị và sự nhồi cột, HPLC nổi lên nhƣ một phƣơng pháp đƣợc ƣa thích cho kĩ thuật tách và phân tích định lƣợng của một dải rộng các mẫu. Phƣơng pháp HPLC hiện đại, nhanh, hiệu quả, có thể dò tìm lƣợng mẫu nhỏ đến 200pg. Những trƣờng hợp áp dụng HPLC hầu nhƣ không có giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghệ. Trong HPLC, hỗn hợp cần phân tích đƣợc hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêm một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và đƣợc mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu đƣợc hòa tan. Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh). Các cấu tử trong mẫu liên tục tƣơng tác với pha tĩnh. Pha động (còn gọi là chất rửa giải) đƣợc bơm qua cột đƣợc nhồi chặt các hạt sắc ký. Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lƣợt thoát ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu đƣợc ghi lại và chuyển ra ngoài một sắc ký đồ, cho biết sự hiện diện của mỗi
cấu tử dƣới dạng một pic. Khi đó lƣợng cấu tử có trong mẫu đƣợc tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
1.2.4. Phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ [8]
Nguyên lý: Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH) để trung hoà hết các axit trong mẫu, với phenolphtalein làm chỉ thị màu.
Xác định hàm lƣợng axit tổng số trong vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88. Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững.
1.2.5. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)[7], [12]
Trong điều kiện bình thƣờng, nguyên tử không hấp thụ hay phát ra năng lƣợng dƣới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản. Đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lƣợng nhất của nguyên tử. Nhƣng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bƣớc sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó, thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bƣớc sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra đƣợc trong quá trình phát xạ. Lúc đó nguyên tử đã nhận năng lƣợng dƣới dạng các tia bức xạ và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lƣợng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó đƣợc gọi là quá trình hấp thụ năng lƣợng của nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trƣờng hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lƣợng muốn có phổ hấp thụ nguyên tử trƣớc hết phải tạo ra đƣợc đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bƣớc sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ năng lƣợng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
Trên cơ sở xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy phổ nguyên tử chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi. Vì vậy muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các bƣớc sau:
-Hoá hơi mẫu phân tích, đƣa về trạng thái khí. Mục đích của quá trình này là tạo ra đƣợc đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích. Có thể nguyên tử hoá mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc bằng kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hƣởng đến kết quả của phép đo AAS.
-Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bƣớc sóng phù hợp với nguyên tử. Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi đi qua môi trƣờng hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích hƣớng vào khe đo để đo cƣờng độ của nó.
-Ghi nhận tín hiệu đo và kết quả đo của cƣờng độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp.
1.2.6. Phƣơng pháp chƣng ninh
Phƣơng pháp chƣng ninh là phƣơng pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Đây là một trong những phƣơng pháp chiết tách đơn giản nhất. Có thể chƣng ninh từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn. Có thể dùng bình cầu có sinh hàn hồi lƣu hay dùng nồi áp suất để chƣng ninh.
Đun nóng hợp chất với dung môi trong nồi áp suất trong một khoảng thời gian nhất định thu đƣợc dịch chiết có lẫn bã rắn. Lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi lọc bỏ bã rắn sẽ thu đƣợc dịch chiết.
Tuy là phƣơng pháp đơn giản nhƣng việc lựa chọn dung môi cũng hết sức nghiêm ngặt. Dung môi sử dụng phải thỏa mãn một số điều kiện sau:
- Hòa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, không hòa tan hay hòa tan rất ít các cấu tử khác. Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu, bắt buộc phải có.
- Không tƣơng tác hóa học với cấu tử cần chiết tách. - Thân thiện với môi trƣờng.
- Không gây độc hại cho ngƣời sử dụng và môi trƣờng xung quanh
- Dễ kiếm, giá thành rẻ.
- Dễ đuổi dung môi ra khỏi dịch chiết.
- Không có tƣơng tác, phá hủy dụng cụ chiết tách…
1.2.7. Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật
Tiêu chuẩn quy định về mật độ cho phép của các vi sinh vật trong thực phẩm thay đổi tùy theo nhóm vi sinh vật cần phân tích, đối tƣợng thực phẩm, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của từng nƣớc. Đối với các vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêu chuẩn thƣờng quy định không cho phép sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong một đơn vị khối lƣợng thực phẩm nhất định. Trƣờng hợp này cần định tính sự hiện diện của vi sinh vật. Thông thƣờng, tiêu chuẩn quy định mật độ vi sinh vật cho phép hiện diện
trong một khối lƣợng thực phẩm nhất định, trong trƣờng hợp này cần tiến hành định lƣợng mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu kiểm tra.
Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm quan trọng đƣợc quy định bởi Bộ Y tế là: tổng số vi khuẩn hiếu khí, E. coli và tổng số nấm men, nấm mốc. Các chỉ tiêu vi sinh vật trên đƣợc dùng để đánh giá chất lƣợng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hƣ hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vi sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - HÓA CHẤT
Hình 2.1. Lò nung và tủ sấy
Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ( Công ty dƣợc danapha Đà Nẵng), tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, phễu chiết, nồi áp suất, bình hút ẩm, buret, pipet, phễu lọc chân không, bếp điện…
Hoá chất: CaCl2, nƣớc cất, fixanal NaOH 0,1N, HNO3, cồn tuyệt đối.
2.2. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 2.3. NGUYÊN LIỆU 2.3. NGUYÊN LIỆU 2.3.1. Cây bứa pH Thể tích Thời gian Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng Đo phổ IR Đo phổ HPLC Canxi hydroxycitrat tinh khiết Tinh chế Xác định hàm lƣợng canxi Tổng hợp Canxi hydroxycitrat Xác định tổng lƣợng axit Định lƣợng các axit (HPLC) Dịch chiết HCA Chiết tách HCA Hàm lƣợng tro Thành phần kim loại
Nguyên liệu sau khi xử lý Xử lý nguyên liệu Xác định độ ẩm Quả bứa Làm sạch Hong khô Xay nhỏ
Cây cao 6- 7m. Cành và nhánh dài, mảnh, mọc xoè ngang. Vỏ cây màu xám tro. Lá mọc đối, mép nguyên, nhẵn bóng, có nhiều điểm mờ. Vỏ quả màu vàng ở ngoài, phía trong hơi đỏ, vị chua, có nhiều múi mọng nƣớc, ăn đƣợc. Hoa có màu vàng nhạt, mọc thành chùm. Quả chín thƣờng đƣợc hái về ăn, vỏ quả phơi khô dùng làm thuốc chữa một số bệnh. thu hái vào các tháng 6-7, quả mọng mang đài tồn tại, vỏ quả dày, có khía múi, phía trong hơi đỏ chứa 6-10 hạt (hình 2.3).
Hình 2.3. Cây và quả bứa ở Quảng Ngãi 2.3.2. Thu nguyên liệu
Nguyên liệu đƣợc lấy ở xã Bình Hải và xã Bình Hoà , huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi. Chọn các loại quả chín có vỏ màu vàng, mềm, ít nhựa, dễ dùng dao để tách lấy vỏ. Cơm bao quanh hạt dày, rõ ràng, màu trắng vàng xem hình 2.4.
Hình 2.4. Quả bứa ở Quảng Ngãi 2.3.3. Xử lý nguyên liệu
Qủa bứa sau khi thu hái còn chứa nhiều tạp chất. Do đó, giai đoạn làm sạch nguyên liệu càng cẩn thận thì hiệu quả của các quá trình chiết tách sau này càng cao. Đầu tiên, nguyên liệu đƣợc thu nhận về cần loại bỏ những quả bị hƣ tổn, quả xanh, loại bỏ hết bụi bẩn, tạp chất bằng cách rửa bằng nƣớc sạch và lau khô bằng vải sạch. Sau khi khô nƣớc, cắt bỏ cuống quả, tách bỏ ruột chỉ lấy phần vỏ và tiến hành làm sạch ruột và hong khô phần vỏ của quả. Vỏ bứa đem sấy khô rồi xay thành bột.
Hình 2.5. Vỏ bứa đã làm sạch
2.4. XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VẬT LÝ
2.4.1. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích
Cân khoảng 10g vỏ bứa tƣơi cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác, sau đó cho vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 800
C trong 3h. Sau khi sấy ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Hình 2.6. Mẫu vỏ quả bứa khô
Dựa vào các kết quả thu đƣợc, ta tính đƣợc khối lƣợng vỏ quả Bứa trƣớc và sau khi sấy. Từ đó, ta tính đƣợc độ ẩm trong vỏ Bứa dựa vào công thức sau: 100 1 o o m m m H Trong đó: - H: độ ẩm (%)
- m0: khối lƣợng vỏ quả tƣơi trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng vỏ quả sau khi sấy (g)
2.4.2. Xác định hàm lƣợng tro
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cân khoảng 4g vỏ đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa vỏ vào lò nung và nung ở 8000
C. Sau 6h ta thấy vỏ đã đƣợc tro hóa hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. dùng kẹp dài lấy bát sứ ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng.
Sau 30 phút tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần liên tiếp là không đổi hay sai số 0,0001 g thì dừng quá trình tro hóa. Hàm lƣợng tro trong vỏ đƣợc tính theo công thức:
100 0 1 m m H
Trong đó: - H: hàm lƣợng tro trong vỏ sấy khô (%)