6. Cấu trúc của luận văn
2.4.6. Xác định hàm lƣợng HCA trong mẫu bằng phƣơng pháp
[12]
HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp đƣợc sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại áp suất thấp hãng Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5m. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò đƣợc thực hiện bằng đetectơ Knauer UV: khoảng bƣớc sóng 190- 740 nm.
Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là H3PO4 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10- 30% trong thời gian 0- 25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu đƣợc lọc qua Millipore lọc 0,45
m và tiêm vào HPLC.
Xây dựng đƣờng chuẩn:
Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10- 32ppm HCA tự do đƣợc tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải đƣợc thực hiện nhƣ phần thảo luận ở trên, và kết quả thu đƣợc các diện tích pic. Đƣờng cong HCA đƣợc vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 3 lần chạy).
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dƣới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) đƣợc định nghĩa nhƣ nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nƣớc cất 2 lần cất, vỏ quả chƣng ninh với nƣớc cất tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu đƣợc tiêm vào HPLC là 20l, HCA thu đƣợc trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng
đƣờng chuẩn. Nồng độ của HCA trong mẫu đƣợc tính bằng g/100g mẫu dựa theo công thức sau:
000 . 10 ) ( % Mn Kpl Vdm Int Am SI HCA
Trong đó: SI: hệ số góc đƣờng chuẩn; Int: hệ số b của đƣờng chuẩn; Am: diện tích pic sắc kí; Vdm: thể tích mẫu sau khi cô đặc dùng cho HPLC; Kpl: hệ số pha loãng; Mn: khối lƣợng mẫu (gam).
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Thông tin chi tiết của chất chuẩn nhƣ sau:
Tên sản phẩm : (-)-Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% Ca.
Số sản phẩm : 55128
Văn phòng sản xuất : Fluka.
Công thức phân tử : C12H10Ca3O16.xH2O.
Khối lượng phân tử : 530,43 (cơ bản khan).
Màu sắc : Hơi nâu.
Dạng tồn tại : Bột.
Chuẩn độ (trao đổi ion) : Axit threo-hydroxycitric 67,3%.
Hàm lượng cacbon : 24,11%.
Hàm lượng Hiđro : 2,82%.
Phổ 1
HNMR : Phù hợp.
Toàn bộ những thông tin trên đƣợc ghi trong Giấy chứng nhận chất lƣợng ngày 4 tháng 2 năm 2005 của hãng Sigma-Aldrich.
Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate (50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5ml nƣớc, và xử lý với 500mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp đƣợc khuấy trong thời gian 10 phút, sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa đƣợc rửa với nƣớc có pH trung tính. Nƣớc rửa và dung dịch đƣợc trộn lẫn tới thể tích 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm.